林碧華，陳婧，郭春連，余海波，張鑫，周克元，△

鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)SOD2可對(duì)抗順鉑的殺傷作用

林碧華1，陳婧2，郭春連3，余海波4，張鑫5，周克元1，5△

目的 探討鼻咽癌（NPC）腫瘤干細(xì)胞對(duì)抗順鉑誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制。方法 利用CCK-8法測定順鉑對(duì)NPC細(xì)胞CNE-2與NPC腫瘤干細(xì)胞CNE-2S的半數(shù)抑制濃度。觀察不同濃度（0.1、0.5、1.0 μmol·L-1）順鉑作用后，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）、總谷胱甘肽（GSH）的含量及總超氧化物歧化酶（SOD）的活性改變。實(shí)時(shí)定量RT-PCR測定1 μmol·L-1順鉑作用于2組細(xì)胞48 h后，谷胱甘肽合成酶（GSS）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基（GCLC）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶調(diào)節(jié)亞基（GCLM）、SOD1和SOD2 mRNA的表達(dá)情況，免疫印跡法檢測SOD2蛋白的表達(dá)情況。利用小干擾RNA技術(shù)沉默SOD2，并與1 μmol·L-1順鉑共處理2組細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞的存活情況。結(jié)果 順鉑對(duì)CNE-2S的半數(shù)抑制濃度顯著高于CNE-2（μmol·L-1：9.8±1.1 vs 2.4±0.6，P＜0.05）。在不同濃度的順鉑處理后，2組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，但CNE-2S在處理前后的ROS水平均低于CNE-2（P＜0.05）。1 μmol·L-1順鉑刺激后，CNE-2S與CNE-2細(xì)胞中GSH含量均上升，但2組細(xì)胞間無明顯差異（P＞0.05）；2組細(xì)胞中SOD活性均上升，且CNE-2S顯著高于CNE-2（P＜0.05）。順鉑處理前后，2組細(xì)胞的GSS、GCLC、GCLM和SOD1的mRNA水平無明顯差異，但CNE-2S中SOD2的mRNA及蛋白表達(dá)水平高于CNE-2（P＜0.05）。沉默SOD2與順鉑共處理2組細(xì)胞，能有效抑制其存活率。結(jié)論 NPC腫瘤干細(xì)胞CNE-2S高表達(dá)SOD2后，抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致對(duì)順鉑的耐藥。

鼻咽癌；腫瘤干細(xì)胞；順鉑；耐藥；氧化應(yīng)激；谷胱甘肽；超氧化物歧化酶；RNA干擾

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）為我國華南地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，在臨床治療中通常以放療為主并輔以適當(dāng)?shù)幕煟?］。雖然NPC患者經(jīng)治療后存活率逐年得到提升，但其復(fù)發(fā)后耐藥性增加是臨床遇到的更大問題。近年來發(fā)展起的腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，傳統(tǒng)的放化療手段無法完全消除腫瘤，因其僅殺滅了已分化的低致瘤性癌細(xì)胞，而殘留的真正致瘤的腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）成為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源［2］。

CSCs具有天然固有的多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR），可通過升高抗氧化應(yīng)激能力為代表的細(xì)胞內(nèi)解毒能力，對(duì)抗順氯氨鉑（cisplatin，CDDP）等一線化療藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）而逃逸相關(guān)的凋亡及壞死［3］。然而針對(duì)NPC CSCs的MDR機(jī)制依然不清，限制了特異性針對(duì)NPC CSCs治療方法的發(fā)展。本文通過比較NPC CSCs與母群細(xì)胞抗ROS能力及機(jī)制的異同，發(fā)現(xiàn)在NPC CSCs特異性高表達(dá)的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）2基因，并利用小分子RNA干擾技術(shù)，在體外初步探索針對(duì)SOD2克服NPC CSCs耐藥的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 NPC細(xì)胞CNE-2為我教研室長期傳代培養(yǎng)及規(guī)范凍存；人NPC細(xì)胞CNE-2S為本課題組利用無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基從CNE-2中用極限稀釋法分離出的細(xì)胞亞群，具有腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)特性［4］。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、B-27添加物及TRIzol購自Invitrogen公司；人表皮生長因子（Human epidermal growth factor，hEGF）、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（Human Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）購自Cell Signal Technology公司；肝素鈉、CDDP購自Sigma公司；SOD檢測試劑盒及CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒購自同仁化學(xué)研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green定量PCR試劑盒購自寶生物公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和SOD2小鼠抗人單抗購自Abcam公司；SOD2 siRNA（h）購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自Merck公司，PVDF膜、ECL發(fā)光液購自Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒、ROS檢測試劑盒、總谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒、RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液購自碧云天生物研究所。7500實(shí)時(shí)定量PCR為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，多功能酶標(biāo)儀為BioTek公司產(chǎn)品，垂直電泳系統(tǒng)、槽式轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)及冷凝CCD成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品，F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細(xì)胞分析儀為BD產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將CNE-2置于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將CNE-2S置于含2%B-27添加物、20 μg/L hEGF、20 μg/L bFGF、10 μg/L肝素鈉、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 CCK-8法測定藥物的殺傷效果 將CNE-2及CNE-2S接種至96孔板正常培養(yǎng)12 h后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入含0.01、0.05、0.1、0.5、1、5及10 μmol·L-1CDDP的完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)48 h后。參考文獻(xiàn)［5］中的CCK-8法測定各濃度的相對(duì)抑制率，利用Origin 8.5軟件回歸后求算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測 根據(jù)所得IC50，選定0.1、0.5 和1 μmol·L-1共3個(gè)濃度分別處理2組細(xì)胞48 h后，消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按說明書裝載DCPH-DA探針于細(xì)胞懸液中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min，PBS洗滌3次后，流式細(xì)胞儀檢測FL1綠光通道信號(hào)。以正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照，利用熒光信號(hào)中值反映ROS水平。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)總GSH含量及SOD活性檢測 按實(shí)驗(yàn)分組處理后，消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，每組取1×107個(gè)細(xì)胞。按說明書通過多功能酶標(biāo)儀測定412 nm處吸光度，利用動(dòng)力學(xué)測定法求算每組樣品中GSH的含量。測定450 nm處吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法求算每組樣品SOD的活性。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR測定相關(guān)基因的mRNA表達(dá) 正常培養(yǎng)及用1 μmol·L-1順鉑處理細(xì)胞48 h后，TRIZol法提取總RNA。測得濃度后按PrimeScript RT reagent Kit說明書操作，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；按SYBR Premix Ex TaqⅡKit說明書操作，相關(guān)基因［SOD1、SOD2、谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSS）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基（GCLC）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶調(diào)節(jié)亞基（GCLM）］引物見表1，在7500實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)上，選用△△Ct相對(duì)定量法進(jìn)行檢測分析，以CNE-2為對(duì)照，GAPDH為內(nèi)參基因，求算各目標(biāo)基因的相對(duì)mRNA表達(dá)量。

Tab.1 A list of primers used in the reactions for real-time q-PCR表1 定量PCR檢測相關(guān)基因的引物

1.2.6 免疫印跡法檢測SOD2蛋白表達(dá) 正常培養(yǎng)及用1 μmol·L-1順鉑處理細(xì)胞48 h后，按文獻(xiàn)［6］中方法加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，按BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，并加入5×蛋白上樣緩沖液。使用SDS-PAGE蛋白電泳系統(tǒng)分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。按抗體說明書要求封閉、孵育抗體，最后加入ECL發(fā)光液，置ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)中，檢測化學(xué)發(fā)光情況。

1.2.7 小RNA干擾 當(dāng)細(xì)胞生長至 70%時(shí)，按 Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行小干擾RNA（siRNA）的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換細(xì)胞培養(yǎng)液為無血清及抗生素的培養(yǎng)基，分別用無血清及抗生素的培養(yǎng)基按比例稀釋Lipofectamine 2000及siRNA（包括si-SOD2及對(duì)照siRNA）并混勻，處理細(xì)胞6 h后更換為完全培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活情況 按1.2.7沉默SOD2后加入順鉑繼續(xù)培養(yǎng)48 h，消化收集細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染液與細(xì)胞懸液等體積混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)計(jì)數(shù)透亮的活細(xì)胞及染上藍(lán)黑色的死細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活情況。

2 結(jié)果

2.1 順鉑對(duì)細(xì)胞的毒性檢測 順鉑對(duì)CNE-2的IC50為（2.4±0.6）μmol·L-1，低于CNE-2S的IC5（09.8±1.1）μmol·L-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.33，P＜0.05）。

2.2 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測 在對(duì)照組及加入梯度濃度的順鉑處理后，CNE-2S的熒光信號(hào)均明顯低于CNE-2的熒光信號(hào)，見圖1。

Fig.1 Histograms show ROS level in cells treated by cisplatin圖1 不同濃度順鉑處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較

2.3 細(xì)胞內(nèi)GSH含量的檢測 對(duì)照組中 CNE-2S 與CNE-2的GSH差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.21，P＞0.05）。用順鉑處理后，2組細(xì)胞中GSH水平均有上升，但同一順鉑濃度處理的2組細(xì)胞間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

Fig.2 Histograms show GSH level in cells treated by cisplatin圖2 不同濃度順鉑處理后2組細(xì)胞內(nèi)GSH水平比較

2.4 細(xì)胞內(nèi)SOD活性的檢測 對(duì)照組及不同濃度順鉑處理后，CNE-2S細(xì)胞的SOD活性均高于CNE-2細(xì)胞（P＜0.05），見圖3。

Fig.3 Histograms show SOD level in cells treated by cisplatin圖3 不同濃度順鉑處理后2組細(xì)胞內(nèi)SOD活性比較

2.5 GSS、GCLC、GCLM、SOD1和 SOD2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)情況 正常培養(yǎng)CNE-2S細(xì)胞的GSS、GCLC、GCLM和SOD1 mRNA水平與CNE-2細(xì)胞無明顯差異（P＞0.05），而CNE-2S組的SOD2 mRNA水平高于CNE-2組（P＜0.05）；1 μmol·L-1順鉑處理后，CNE-2S組的SOD2 mRNA水平高于CNE-2組（P＜0.05），其他基因亦無明顯差異（P＞0.05），見表2、3。

Tab.2 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in normal cultured cells were examined by real-time q-PCR表2 正常培養(yǎng)的2組細(xì)胞內(nèi)GSS、GCLC、GCLM、SOD1 和SOD2基因的mRNA水平比較 （±s）

Tab.2 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in normal cultured cells were examined by real-time q-PCR表2 正常培養(yǎng)的2組細(xì)胞內(nèi)GSS、GCLC、GCLM、SOD1 和SOD2基因的mRNA水平比較 （±s）

＊P＜0.05

組別CNE-2組CNE-2S組t SOD1 1.00±0.12 0.97±0.09 0.61 n66 GSS 1.00±0.12 0.96±0.11 0.72 GCLC 1.00±0.09 1.03±0.11 0.57 GCLM 1.00±0.13 1.16±0.17 2.17 SOD2 1.00±0.11 3.02±0.19 26.58＊

Tab.3 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in cisplatin treated cells were examined by real-time q-PCR表3 1 μmol·L-1順鉑處理后2組細(xì)胞內(nèi)GSS、GCLC、GCLM、SOD1和SOD2基因的mRNA水平比較（±s）

Tab.3 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in cisplatin treated cells were examined by real-time q-PCR表3 1 μmol·L-1順鉑處理后2組細(xì)胞內(nèi)GSS、GCLC、GCLM、SOD1和SOD2基因的mRNA水平比較（±s）

＊P＜0.05

?

2.6 SOD2蛋白表達(dá)情況 CNE-2S的SOD2蛋白水平高于CNE-2，順鉑處理后SOD2蛋白表達(dá)量上升，見圖4。沉默SOD2后，si-SOD2組的SOD2蛋白水平低于對(duì)照siRNA組，見圖5。

Fig.4 SOD2 protein expressed in cisplatin treated cells，examined by Western blotting圖4 順鉑處理后細(xì)胞內(nèi)SOD2蛋白水平檢測

2.7 沉默SOD2增強(qiáng)順鉑對(duì)NPC細(xì)胞的殺傷作用 相對(duì)于對(duì)照siRNA處理，si-SOD2與順鉑聯(lián)用能顯著殺傷CNE-2及CNE-2S細(xì)胞（P＜0.05），見表4。

Fig.5 SOD2 protein expressed in SOD2 silenced cells，detected by Western blotting圖5 沉默SOD2后細(xì)胞內(nèi)SOD2蛋白水平檢測

Tab.4 Cell viability was detected by trypan blue staining表4 臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活情況 （±s）

Tab.4 Cell viability was detected by trypan blue staining表4 臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活情況 （±s）

＊P＜0.05

組別CNE-2組CNE-2S組n 66細(xì)胞存活率（%）對(duì)照siRNA+順鉑32.4±5.2 53.2±8.3沉默SOD2+順鉑13.7±4.1 39.4±6.7 t 7.73＊12.86＊

3 討論

眾多研究證明，NPC組織和細(xì)胞中存在CSCs，且CSCs具有持續(xù)的自我更新能力、更強(qiáng)的體內(nèi)致瘤性及耐藥性增強(qiáng)等特性［7-8］。CSCs能通過多種機(jī)制產(chǎn)生MDR，包括：增強(qiáng)藥物外排能力，增強(qiáng)細(xì)胞解毒能力，增強(qiáng)DNA修復(fù)能力，激活抗凋亡相關(guān)信號(hào)通路等［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，利用懸浮培養(yǎng)法從NPC細(xì)胞CNE-2中分離得到的具有CSCs特性的CNE-2S細(xì)胞，對(duì)順鉑具有更強(qiáng)的耐受能力，且具有更強(qiáng)的ROS消除能力。在NPC的放化療治療過程中，化療藥物和放射線能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，無法被清除的ROS能破壞細(xì)胞內(nèi)生物大分子，進(jìn)而通過多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這是放化療殺滅腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制之一［10］。

GSH是一種含巰基活性三肽，能作為底物與順鉑等抗腫瘤藥物結(jié)合，或直接與自由基等反應(yīng)而發(fā)揮解毒作用［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然順鉑能誘導(dǎo)CNE-2S與CNE-2細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更多的GSH，但同一順鉑濃度作用下，2組細(xì)胞內(nèi)GSH的含量并無明顯差別，提示雖然順鉑能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增加GSH，但與NPC腫瘤干細(xì)胞耐藥無直接關(guān)系。為進(jìn)一步從基因調(diào)控水平驗(yàn)證此推斷，本研究用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了與GSH合成有關(guān)的3個(gè)基因GSS、GCLC和GCLM的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，順鉑能誘導(dǎo)2組細(xì)胞上調(diào)GSH合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，但CNE-2S與CNE-2間無明顯差異。筆者初步推測NPC腫瘤干細(xì)胞群CNE-2S相對(duì)于母群細(xì)胞對(duì)抗順鉑殺傷作用的增強(qiáng)，可能為非依賴GSH的機(jī)制。

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠催化超氧化物通過系列反應(yīng)最終生成氧氣和水，從而保護(hù)細(xì)胞免受ROS的損害［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑能誘導(dǎo)NPC細(xì)胞內(nèi)總SOD的活性增強(qiáng)，且CNE-2S細(xì)胞內(nèi)SOD的活性高于母群細(xì)胞CNE-2，提示NPC腫瘤干細(xì)胞耐藥特性可能與細(xì)胞高表達(dá)SOD有關(guān)。人體細(xì)胞中的SODs包括3種同工酶：位于胞漿的銅鋅超氧化物歧化酶（Cu-Zn-SOD，SOD1），位于線粒體的錳超氧化物歧化酶（MnSOD，SOD2）和分泌到細(xì)胞外的細(xì)胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD，SOD3）。為了從基因調(diào)控水平驗(yàn)證SOD與NPC腫瘤干細(xì)胞耐藥有關(guān)，本研究進(jìn)一步檢測了SOD1、SOD2基因的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)順鉑能上調(diào)SOD2的轉(zhuǎn)錄及翻譯，對(duì)SOD1的轉(zhuǎn)錄并無顯著影響，且CNE-2S相對(duì)于CNE-2高表達(dá)SOD2，免疫印跡對(duì)SOD2蛋白表達(dá)水平的驗(yàn)證與mRNA水平結(jié)果一致。此外，F(xiàn)eng等［13］通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析提出，通過檢測腫瘤組織中SOD2表達(dá)量能對(duì)患者放療效果進(jìn)行預(yù)測。綜上結(jié)果表明，具有CSC特性的CNE-2S細(xì)胞可能通過高表達(dá)SOD2抑制了順鉑誘導(dǎo)的ROS，從而增強(qiáng)了對(duì)順鉑的抗殺傷作用。

為初步探討抑制SOD2能否逆轉(zhuǎn)CNE-2S對(duì)順鉑的耐藥，本研究利用siRNA技術(shù)沉默2種NPC細(xì)胞中SOD2的表達(dá)，并聯(lián)用順鉑處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，沉默SOD2能增強(qiáng)順鉑對(duì)NPC腫瘤干細(xì)胞及母群細(xì)胞的殺傷作用。此外，Qu等［14-15］分別通過微小RNA （microRNA）及小發(fā)夾RNA（shRNA）技術(shù)沉默NPC細(xì)胞中CNE-1及CNE-2的SOD2表達(dá)，均能增強(qiáng)發(fā)射線對(duì)2組細(xì)胞的殺傷作用。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，特異性沉默SOD2能增強(qiáng)放化療對(duì)NPC細(xì)胞的殺傷。但本研究結(jié)果顯示，沉默SOD2并不能完全逆轉(zhuǎn)CNE-2S對(duì)順鉑的敏感，提示SOD2的過表達(dá)雖是NPC腫瘤干細(xì)胞CNE-2S對(duì)順鉑耐藥的機(jī)制之一，但可能還有其他機(jī)制。

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（2014-12-05收稿 2015-02-12修回）

（本文編輯 閆娟）

Nasopharyngeal carcinoma stem cells develop resistant against Cisplatin through upregulating SOD

LIN Bihua1，CHEN Jing2，GUO Chunlian3，YU Haibo4，ZHANG Xin5，ZHOU Keyuan1，5△
1 Department of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Medical College，Dongguan，Guangdong 523808，China；2 Department of Pharmacy，Dongguan People's Hospital；3 Department of Pharmacology，Guangdong Medical College，Dongguan；4 Centre for Tender and Bidding，Guangdong Medical College；5 Key Laboratory for Medical Molecular Diagnostics of Guangdong Province
△Corresponding Author Email:kyz009@126.com

Objective To investigate the way that nasopharyngeal carcinoma（NPC）and NPC stem cells develops resistance to cisplatin through anti-reactive oxygen species mechanism.Methods Using CCK-8 cell counting kit，we measured the half inhibitory concentration of cisplatin against NPC cells"CNE-2"and NPC stem cells"CNE-2S"，and compared their resistant index.We examined the differences in the reactive oxygen species（ROS）levels，total glutathione（GSH）levels，and total superoxide dismutase（SOD）levels between CNE-2 and CNE-2S at different concentrations of cisplatin administration（0.1，0.5 and 1.0 μmol·L-1）.Using q-PCR，we determined the mRNA expression level of GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 after 48 hours administration of cisplatin at 1 μmol·L-1.Protein expression level of SOD2 was also tested using Western Blot after 48 hours administration of cisplatin at 1 μmol·L-1.Upon silencing the SOD2 in NPC cell through siRNA，Trypan blue was used to analyze cell survival after cisplatin was administrated at 1 μmol·L-1.Results The inhibition concentration of cisplatin against CNE-2 was higher than that against CNE-2S（μmol·L-1：9.8±1.1 vs 2.4±0.6，P＜0.05）.ROS levels in CNE-2 and CNE-2S both rise with cisplatin administration，but ROS levels of CNE-2 before and after cisplatin treatment were both higher than those in CNE-2S（P＜0.05）.The total glutathione levels in CNE-2 and CNE-2S were both increased after 1 μmol·L-1cisplatin treatment but there is no significant difference in levels of glutathione between these two cell lines.After treated with cisplatin，SOD level were increased in both CNE-2S and CNE-2，but it is higher in CNE-2S than that in CNE-2（P＜0.05）.The mRNA levels of GSS，GCLC，GCLM，and SOD1 were not different significantly between in CNE-2 and in CNE-2S with or without cisplatin treatment.However，SOD2 in CNE-2S were higher than that in CNE-2 on both mRNA and protein levels（P＜0.05）.Silenced SOD2 disrupted the resistance of cisplatin in CNE-2S.Conclusion These data suggest that NPC stem cells（CNE-2S）enhance its drug resistance to cisplatin through highly expression of SOD2 which posed anti-ROS capacity.

nasopharyngeal carcinoma；cancer stem cells；Cisplatin；drug resistance；reactive oxygen；glutathione；superoxide dismutase；RNA interference

R739.6

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81272434）；湛江市科技攻關(guān)計(jì)劃（2013B01091）；廣東醫(yī)學(xué)院青年基金（Q2012005）；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310571004）；廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（1057113030）；廣東醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目立項(xiàng)（ZZDM012，ZZDM013）

1廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室（郵編523808）；2東莞市人民醫(yī)院；3廣東醫(yī)學(xué)院藥劑學(xué)教研室；4廣東醫(yī)學(xué)院招投標(biāo)中心；5廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

林碧華（1982），女，碩士，主要從事中藥小分子抗腫瘤機(jī)制研究

△E-mail:kyz009@126.com