崔海忠，肖娜，張永平，陳大貴，唐一通△

新技術(shù)交流

連接酶-ELISA反應(yīng)檢測(cè)循環(huán)DNA基因突變研究

崔海忠1，肖娜2，張永平1，陳大貴1，唐一通2△

目的 研究一種簡(jiǎn)便、靈敏的單核苷酸多態(tài)性（SNP）分型方法，使其能夠在簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行常規(guī)的臨床樣本檢測(cè)。方法 設(shè)計(jì)針對(duì)突變位點(diǎn)的檢測(cè)探針，通過檢測(cè)探針的連接、通用擴(kuò)增、標(biāo)記和ELISA反應(yīng)，根據(jù)檢測(cè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)反應(yīng)管顯色值判定突變位點(diǎn)的基因型。以表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因外顯子21和18上的3個(gè)SNP突變位點(diǎn)L858R、L861Q和G719C為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)62例肺癌血漿循環(huán)DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，并與直接測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 通過對(duì)3個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，2種方法均在L858R位點(diǎn)檢出雜合子突變。直接測(cè)序法僅能夠明確檢出2例雜合子突變，另外1例樣本因在突變位點(diǎn)出現(xiàn)不明顯的套峰而無法明確判定突變類型。而新方法能夠明確檢出6例雜合子突變。結(jié)論 建立了一種基于連接酶-ELISA的簡(jiǎn)便、靈敏的SNP突變檢測(cè)方法，適合于在簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)不均一樣本進(jìn)行常規(guī)突變檢測(cè)。

多態(tài)性，單核苷酸；突變；基因型；DNA連接酶類；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）被認(rèn)為是疾病易感性和藥物反應(yīng)的決定因素之一，開展SNP研究對(duì)遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與合理用藥等的發(fā)展都具有重要意義。目前，SNP突變檢測(cè)方法主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）［1］、DNA測(cè)序、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）［2］、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）［3］、TaqMan PCR［4］、焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）［5-6］、質(zhì) 譜 技 術(shù)（Mass Spectrometry）［7］、SNPstream技術(shù)［8］、分子燈塔技術(shù)［9］、液相芯片技術(shù)［10］等。傳統(tǒng)的DNA測(cè)序檢測(cè)靈敏度較低［11］，因此在對(duì)腫瘤組織、穿刺活檢組織或體液樣本等不均一樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)有較大局限性。雖然質(zhì)譜、Pyrosequencing等技術(shù)檢測(cè)靈敏度較高，但其對(duì)實(shí)驗(yàn)條件、儀器設(shè)備、試劑等具有很高的要求，在簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)條件下的常規(guī)臨床檢測(cè)中難以廣泛應(yīng)用。筆者通過對(duì)構(gòu)建質(zhì)粒模板的檢測(cè)，建立了一種新的SNP檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)5%［12］。本文進(jìn)一步通過對(duì)非小細(xì)胞肺癌循環(huán)DNA的檢測(cè)，研究一種基于連接酶-ELISA的簡(jiǎn)便、靈敏的SNP突變檢測(cè)方法，使其適合于在簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)不均一樣本進(jìn)行常規(guī)臨床檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 寡核苷酸探針：表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因外顯子21和18上的3個(gè)突變位點(diǎn)L858R、L861Q、G719C的檢測(cè)探針序列，見表1。對(duì)檢測(cè)探針進(jìn)行通用引物擴(kuò)增的Tag1序列和Tag2的互補(bǔ)序列（CTag2）分別為Tag1：5′biotin-GGGTTCGTGGTAGAGCGTCGGAGT-3′；CTag2：5′digoxin-CCAGACGACACCGAGATAGCAGCC-3′。Tag1和CTag2序列5′端分別為生物素（biotin）和地高辛（digoxin）分子修飾。所有核酸序列均由上海生工生物有限公司合成。

樣本來源：收集湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院及棗陽臨床學(xué)院2013年6月—2014年8月確診的非小細(xì)胞肺癌患者血漿樣本62例（36例腺癌，26例鱗癌）。其中男37例，女25例。

實(shí)驗(yàn)試劑：低分子質(zhì)量DNA Marker-A購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；2×PCR Mastermix購(gòu)自天根生化科技北京有限公司；鏈親和素磁珠、磁性分離器購(gòu)自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司；Taq DNA ligase購(gòu)自New England BioLabs；QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN）購(gòu)自上海葉舟生物科技有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EGFR基因擴(kuò)增 用QIAamp DNA Blood Mini Kit抽提血漿樣本循環(huán)DNA。對(duì)外顯子18和21進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為：21-forward：5′-GAGCTTCTTCCCATGATGATCT-3′；21-reverse：5′-GAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3′；18-forward：5′-GAGGTGACCCTTGTCTCTGTGT-3′；18-reverse：5′-CCCAAACACTCAGTGAAACAAA-3′。擴(kuò)增體系為：3 μL循環(huán)DNA樣本，0.5 μmol/L擴(kuò)增引物，10 μL 2×Taq PCR Mastermix，去離子水補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增條件為：95℃4 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃4 min。測(cè)定各樣本擴(kuò)增產(chǎn)物序列。

1.2.2 突變檢測(cè) （1）連接反應(yīng)。針對(duì)某個(gè)SNP位點(diǎn)，用上游的2條特異性檢測(cè)探針和下游的1條公用探針進(jìn)行檢測(cè)。L858R、L861Q、G719C 3個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)探針同前期建立方法［12］。每組3個(gè)檢測(cè)管（標(biāo)記為WT、MT和對(duì)照CT管）用來檢測(cè)1個(gè)SNP位點(diǎn)。WT和MT管分別加入2 μL 10×連接反應(yīng)緩沖液，2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物和1 U Taq ligase，在MT管中加入0.1 pmol突變型特異性檢測(cè)探針和公用檢測(cè)探針，WT管中加入0.1 pmol野生型特異性檢測(cè)探針和公用檢測(cè)探針，去離子水補(bǔ)足20 μL。對(duì)照管CT中不加入模板序列，其他成分與檢測(cè)管相同。反應(yīng)條件為：94℃1 min，57℃2 min；5個(gè)循環(huán)；95℃5 min。（2）通用引物擴(kuò)增。取2×PCR Mastermix 10 μL，各管連接反應(yīng)產(chǎn)物2 μL，2 μmol/L通用擴(kuò)增引物Tag1和CTag2，去離子水補(bǔ)足20 μL。95℃30 s；95℃25 s，65℃45 s，72℃20 s；20個(gè)循環(huán)，72℃1 min進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。（3）ELISA檢測(cè)。將擴(kuò)增產(chǎn)物移入96孔板對(duì)應(yīng)孔中，鏈親和素磁性微粒進(jìn)行純化，將磁性微粒保存于20 μL Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L，pH 7.5）中。各孔中加入50 μL HRP標(biāo)記抗地高辛抗體溶液（20%胎牛血清1∶1 000稀釋），恒溫?fù)u床中室溫，70 r/min，30 min。磁性分離，200 μL清洗緩沖液（1× PBST）清洗3次，加入TMB底物緩沖液100 μL，室溫顯色5 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，設(shè)定背景波長(zhǎng)595 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，酶標(biāo)儀（ELX 800 UV，BIO-TEK INSTRUMENTS，INC）測(cè)定各孔光密度（OD450）值。根據(jù)各檢測(cè)位點(diǎn)WT管、MT管和CT管對(duì)應(yīng)各孔顯色值（ODWT、ODMT和ODCT）判定所檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型（ODCT＜0.05時(shí)，以O(shè)DCT=0.05計(jì)算）。以O(shè)DWT/ODCT和ODMT/ODCT比值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)：若ODWT/ODCT＞5，同時(shí)ODMT/ODCT＞5，則此檢測(cè)位點(diǎn)為雜合子突變；若只有ODWT/ODCT＞5，則此檢測(cè)位點(diǎn)為野生純合子；若只有ODMT/ ODCT＞5，則此檢測(cè)位點(diǎn)為突變純合子。

1.2.3 檢測(cè)流程 野生純合子SNP位點(diǎn)的檢測(cè)流程，見圖1。通過連接反應(yīng)，WT管中野生型檢測(cè)探針和公用探針能完成連接，而MT管中突變型檢測(cè)探針和公用探針不能連接，經(jīng)通用引物Tag1和CTag2的通用擴(kuò)增和標(biāo)記，通過ELISA進(jìn)行分型檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可通過觀察WT管和MT管對(duì)應(yīng)顯色孔顯色值來判定。結(jié)果判定方法為，若只在WT管對(duì)應(yīng)顯色孔有顯色值，則檢測(cè)位點(diǎn)為野生型；若WT、MT管對(duì)應(yīng)顯色孔均有顯色值，則為雜合突變型；若只在MT管對(duì)應(yīng)顯色孔有顯色值，則為純合突變型。

Tab.1 The sequences of oligonucleotide probes表1 寡核苷酸檢測(cè)探針序列

Fig.1 Schematic representation of ligation-ELISA assay圖1 連接酶-ELISA分型方法檢測(cè)流程圖

2 結(jié)果

對(duì)62例樣本L858R、L861Q和G719C 3個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，并與直接測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了比較。2種方法未檢測(cè)到L861Q和G719C位點(diǎn)的突變，但均檢測(cè)到L858R位點(diǎn)有雜合子突變。直接測(cè)序僅可以明確檢測(cè)出8#、15#2例樣本是L858R位點(diǎn)雜合子突變，而23#樣本出現(xiàn)類似雜峰的突變堿基對(duì)應(yīng)峰，無法得出明確的基因型判斷；6#、11#、14#樣本因?yàn)橥蛔儔A基對(duì)應(yīng)峰無法從雜峰中分離，更加不能檢出突變基因型，見圖2。連接酶-ELISA方法共檢測(cè)出6#、8#、11#、14#、15#、23#共6例樣本是L858R雜合子突變。且6個(gè)突變型樣本對(duì)應(yīng)WT管在450 nm處的ODWT在1.58和1.82之間，MT管在450 nm 處ODMT均高于0.96，ODWT/ODCT和ODMT/ODCT均大于10，見表2。野生型樣本中（37#、42#、50#、58#樣本），各WT管在450 nm處ODWT大于1.5，MT管的450 nm處ODMT均低于0.16，ODWT/ODCT大于10，而ODMT/ODCT均小于5。另外，ODMT（雜合）/ODMT（野生）均高于5。且ODWT/ODCT及ODWT/ODMT也均高于10。因此，新建立方法有著簡(jiǎn)便、靈敏的特點(diǎn)，適合于從不均一的樣本中進(jìn)行突變等位基因的檢測(cè)。6例突變樣本（6#、8#、11#、14#、15#、23#）和4例野生型樣本（37#、42#、50#、58#）對(duì)應(yīng)各檢測(cè)管的顯色值見表2。

Fig.2 Results of direct sequencing for L858R in EGFR of circulating DNA samples圖2 循環(huán)DNA樣本EGFR基因L858R位點(diǎn)測(cè)序圖

Tab.2 Genotyping of the circulating DNA samples for L858R in EGFR with ELISA表2 循環(huán)DNA樣本EGFR基因L858R位點(diǎn)ELISA基因型分型檢測(cè) （n=62，±s）

Tab.2 Genotyping of the circulating DNA samples for L858R in EGFR with ELISA表2 循環(huán)DNA樣本EGFR基因L858R位點(diǎn)ELISA基因型分型檢測(cè) （n=62，±s）

檢測(cè)管6#樣8 本#中各檢測(cè)11 管#對(duì)應(yīng)顯色14 值#15# WT1.65±0.071.78±0.131.63±0.121.82±0.161.63±0.08 MT1.22±0.071.81±0.150.96±0.051.27±0.081.60±0.06 CT0.04±0.030.08±0.020.06±0.020.07±0.020.07±0.01檢測(cè)管23#樣37 本#中各檢測(cè)42 管#對(duì)應(yīng)顯色50 值#58# WT1.58±0.091.52±0.101.82±0.151.71±0.071.88±0.14 MT1.41±0.020.12±0.040.14±0.060.15±0.030.16±0.02 CT0.06±0.030.06±0.030.07±0.020.05±0.040.08±0.02

3 討論

3.1 SNP檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用現(xiàn)狀 近年來SNP的檢測(cè)方法被廣泛研究。但SNP檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)成本、靈敏度和常規(guī)性等方面仍需改進(jìn)。如DNA直接測(cè)序的靈敏度僅有20%［11］，在對(duì)不均一樣本進(jìn)行突變檢測(cè)時(shí)，無法將突變等位基因?qū)?yīng)峰線從背景峰中明確分離，從而造成假陰性結(jié)果。雖然焦磷酸測(cè)序、實(shí)時(shí)定量PCR等方法具有較高靈敏度，報(bào)道稱可達(dá)到5%［13］和1%［14］，但這些方法需依賴昂貴儀器或?qū)I(yè)人員的技術(shù)支持，且操作復(fù)雜，不能在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行突變檢測(cè)，限制了其在基層醫(yī)療和研究機(jī)構(gòu)的應(yīng)用。

3.2 建立方法靈敏度及應(yīng)用性分析 本研究方法具有較高檢測(cè)靈敏度，通過在檢測(cè)探針上設(shè)計(jì)通用擴(kuò)增引物序列Tag1和Tag2，完成連接反應(yīng)后，進(jìn)行連接探針的二次擴(kuò)增，以大大增加檢測(cè)產(chǎn)物的數(shù)量，從而進(jìn)一步在ELISA水平進(jìn)行快速檢測(cè)，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)5%［12］，因此適合于從不均一樣本中對(duì)突變等位基因進(jìn)行檢測(cè)。通過對(duì)62例樣本的檢測(cè)，結(jié)果表明，直接測(cè)序結(jié)果僅能夠明確檢出2例，而其他3例因無法有效區(qū)分背景峰，不能明確判定。而本方法能夠根據(jù)ELISA結(jié)果從中明確判定出6例雜合子樣本，具有較高的檢測(cè)靈敏度。此外，與其他檢測(cè)方法如焦磷酸測(cè)序、熒光定量PCR、質(zhì)譜等方法相比，本方法操作簡(jiǎn)單，不需借助昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備，只需普通PCR儀、酶標(biāo)儀等簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)條件即能完成。同時(shí)，所需檢測(cè)探針長(zhǎng)度均小于50 bp，合成成本低，也沒有對(duì)熒光探針等昂貴試劑及高質(zhì)量檢測(cè)樣本的要求，具有較低的檢測(cè)成本和易操作性，因此更加適合于在普通簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測(cè)。

3.3 建立方法特異性分析 為保證本方法具有較高的檢測(cè)特異性，在設(shè)計(jì)檢測(cè)探針時(shí)，除依靠特異性檢測(cè)探針3′端堿基與突變堿基的配對(duì)識(shí)別能力外，還在其3′端上游第3個(gè)堿基處引入1個(gè)錯(cuò)配堿基以增強(qiáng)探針的識(shí)別能力。同時(shí)，特異性檢測(cè)探針和公用探針的H1和H2序列的Tm值與通用擴(kuò)增引物Tag1和Tag2序列的Tm值相差7～8℃，以減少連接反應(yīng)和后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)之間的影響。

總之，本研究通過對(duì)非小細(xì)胞肺癌循環(huán)DNA樣本的檢測(cè)，建立了一種基于連接酶-ELISA的簡(jiǎn)便、靈敏的SNP突變檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)便，有較高的檢測(cè)特異性和靈敏度，適合于在一般實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)不均一樣本進(jìn)行常規(guī)突變檢測(cè)。但因ELISA方法的固有局限性，本方法不能對(duì)未知SNP位點(diǎn)進(jìn)行突變檢測(cè)，且在檢測(cè)通量上也有限制，不適合于進(jìn)行高通量檢測(cè)。

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（2014-09-15收稿 2014-12-10修回）

（本文編輯 李鵬）

Study for gene mutation detection of circulating DNA with ligase-ELISA reaction

CUI Haizhong1，XIAO Na2，ZHANG Yongping1，CHEN Dagui1，TANG Yitong2△
1 Zaoyang Clinical College，Medical College of Hubei University of Arts and Science，Zaoyang 441200，China；2 Key Laboratory of Molecular Medicine，Medical College of Hubei University of Arts and Science
△Corrsponding Author E-mail：yitongtang@126.com

Objective To establish a single nucleotide polymorphisms genotyping（SNP）method for a convenient，accurate，and routine analysis of clinical samples.Methods Based on the design of oligonucleotide probe，the assay was performed through three steps:the conjunction of the detection probe，universal amplification，labeling and ELISA reaction.The genotype of each SNP was revealed by reading signals of each set of reaction tubes.This assay was applied to detect sixtytwo plasma samples of lung cancer for circulating DNA for three SNPs of EGFR，c.2573T＞G（L858R），EGFR，c.2582T＞A （L861Q），EGFR，c.2155 G＞T（G719C）.Results were compared with those obtained by direct sequencing.Results The heterozygote mutation was identified for L858R by both methods，although no mutation was detected for L861Q and G719C.Six samples were identified as heterozygotes with the new method，and only two samples were unambiguously identified as heterozygotes by the direct sequencing.Two additional samples could not be identified as heterozygotes because the peak of mutant allele was very low compared with that of wild allele.Conclusion The developed method enabled accurate identification of SNP in a convenient manner，and which is adapted to routine analysis from heterogeneous samples unambiguously.

polymorphism，single nucleotide；mutation；genotype；DNA ligases；enzyme-linked immunosorbent assay

R394-33

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.023

湖北省衛(wèi)生計(jì)生科研基金（WJ2015MB266）；襄陽市科技局項(xiàng)目（襄科業(yè)［2012］43號(hào)）；湖北省教育廳項(xiàng)目（Q20132604）；湖北省教育廳高校青年教師深入企業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（XD2014245）

1湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院棗陽臨床學(xué)院（郵編441200）；2湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

崔海忠（1972），男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤學(xué)方面研究

△E-mail：yitongtang@126.com