嚴(yán)濤

鈷鉻合金與鈦合金修復(fù)材料的細(xì)胞相容性研究

嚴(yán)濤

目的 研究2種牙科金屬材料鈷鉻合金、鈦合金浸提液對人牙齦成纖維（HGF）細(xì)胞的細(xì)胞相容性。方法 以鈷鉻合金、鈦合金的浸提液培養(yǎng)HGF細(xì)胞，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為空白對照。采用MTT法在細(xì)胞水平評價(jià)2種牙科金屬材料的細(xì)胞毒性，使用試劑盒檢測細(xì)胞中還原型谷胱甘肽（rGSH）的含量，采用ELISA法檢測2種牙科金屬材料浸提液對HGF細(xì)胞腫瘤壞死因子（TNF）-α分泌的影響，采用實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）在基因水平檢測2種牙科金屬材料浸提液對HGF細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase-3 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果 鈷鉻合金組抑制了HGF細(xì)胞增殖，與空白對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，鈦合金組促進(jìn)了HGF細(xì)胞增殖。與空白對照相比，鈷鉻合金組抑制了HGF細(xì)胞rGSH的產(chǎn)生（P＜0.05），促進(jìn)了HGF細(xì)胞TNF-α的分泌（P＜0.05），而鈦合金對HGF細(xì)胞rGSH產(chǎn)生、TNF-α分泌沒有明顯影響；鈷鉻合金組caspase-3的基因表達(dá)高于空白對照組（P＜0.05），而鈦合金對caspase-3基因表達(dá)無明顯影響。結(jié)論 鈷鉻合金對HGF細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性，而鈦合金細(xì)胞相容性良好。

鉻合金；鈦；谷胱甘肽；腫瘤壞死因子α；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；鈷鉻合金；鈦合金；人牙齦成纖維細(xì)胞；細(xì)胞相容性

過去幾十年間，隨著對金、鈀等貴金屬合金價(jià)格管制的放寬，人們開始尋求新的非貴金屬合金［1］。在選擇合金的過程中需要考慮的一個(gè)重要因素就是它的生物學(xué)性質(zhì)。近年來，鈷鉻合金［2］及鈦合金因其良好的機(jī)械性能在口腔修復(fù)領(lǐng)域得到了大量應(yīng)用。由于口腔內(nèi)唾液的溶解、細(xì)菌活性及溫度等綜合因素的影響，金屬材料處于一個(gè)易于生物降解的環(huán)境中［3］。金屬離子釋放到口腔后，會接觸毗鄰的細(xì)胞及組織，并通過血液流動而分布到全身各處，可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性、過敏等不良反應(yīng)。因此對于口腔內(nèi)金屬材料的生物安全性評價(jià)尤為重要。本研究選取人牙齦成纖維（HGF）細(xì)胞，觀察2種金屬浸提液的細(xì)胞毒性，及對細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（rGSH）含量及腫瘤壞死因子（TNF）-α分泌的影響，并進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）技術(shù)檢測caspase-3基因表達(dá)的變化，旨在評價(jià)2種口腔修復(fù)科常用金屬材料的細(xì)胞相容性，為其臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 鈷鉻合金、鈦合金購自Bego公司。鈷鉻合金成分：鈷（Co）61%、鉻（Cr）24%、鉬（Mo）7%、鎢（W）4.5%，Si、Fe、Ce各小于2%。鈦合金成分：鈦（Ti）4%，鎳（Ni）62%，Cr 17%。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；Ⅰ型膠原酶、MTT購自美國Sigma公司；DMSO購自美國Amerisco公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreen購自TaKaRa公司；rGSH測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒購自吉泰遠(yuǎn)成生物科技有限公司；real-time PCR儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 浸提液制備 將鈷鉻合金、鈦合金分別鑄造成直徑6 mm，高3 mm的圓柱體，打磨、拋光后，超聲清洗15 min。用去離子水沖洗數(shù)遍后，置于玻璃小瓶中，將不同合金的金屬片于121℃高壓滅菌后，置于24孔板中。每孔加2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。在37℃、5%CO2條件下連續(xù)浸提7 d，將浸提液用0.2 μm過濾器過濾，4℃冰箱保存，備用。

1.3 HGF細(xì)胞的原代培養(yǎng) 選取20～24歲青少年因正畸拔除的前磨牙，用PBS（含雙抗）反復(fù)沖洗，無菌條件下刮取牙頸部的牙齦組織，剪碎后用2.0×105U/LⅠ型膠原酶37℃消化1 h，800 r/min離心5 min，棄上清，用無血清DMEM培養(yǎng)液懸浮組織，800 r/min離心5 min，棄上清，加適量含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，連同組織塊轉(zhuǎn)至6孔板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。每2～3 d換液1次，取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn) 將HGF細(xì)胞按照1×104/孔的濃度接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，棄去原液，加入2種金屬浸提液，培養(yǎng)24 h后，加入20 μL MTT（5 g/L）作用4 h，然后加入150 μL DMSO溶解結(jié)晶，用分光光度儀（Labsystems Dragon Wellscan MK3，F(xiàn)inland）在570 nm和630 nm處測量光密度（OD）值。按OD值計(jì)算細(xì)胞活力。計(jì)算細(xì)胞相對增殖R，R=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%，正常培養(yǎng)液組為空白對照組。

1.5 細(xì)胞內(nèi)rGSH含量的測定 HGF細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/孔接種于6孔板中，每孔2 mL，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)，加入2 mL金屬浸提液，同時(shí)設(shè)置空白對照組（正常DMEM培養(yǎng)液）。置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，PBS洗滌細(xì)胞1次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清，加入細(xì)胞沉淀體積3倍量的偏磷酸緩沖液充分混懸，利用液氮和37℃水浴對樣品進(jìn)行3次快速的凍融，4℃、3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，按照試劑盒說明書測定rGSH含量。用Bradford法測定細(xì)胞蛋白水平校正細(xì)胞內(nèi)rGSH含量。

1.6 ELISA實(shí)驗(yàn) 將成纖維細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板中。24 h后每孔加入2 mL上述金屬浸提液，作用24 h后，收集上清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作測定TNF-α含量，正常培養(yǎng)液組為空白對照組。

1.7 real-time PCR實(shí)驗(yàn) 用real-time PCR方法研究金屬浸提液對HGF細(xì)胞caspase-3基因表達(dá)的影響。使用2種牙科金屬材料浸提液處理HGF細(xì)胞24 h后，使用TRIZOL試劑（Invitrogen，USA）提取總RNA。使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit（TaKaRa，Japan）將1.0 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用real-time PCR試劑（SYBR Premix EX Taq，TaKa-Ra），在Bio-Rad系統(tǒng)（MyiQ2，USA）上進(jìn)行real-time PCR檢測。以GAPDH為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)用ΔΔCt方法進(jìn)行分析，用GAPDH進(jìn)行標(biāo)化。正常培養(yǎng)液組為空白對照組。引物序列見表1。

Tab.1 Primers used for real time RT-PCR表1 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)中所用的引物

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)取得的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HGF細(xì)胞形態(tài)觀察 HGF細(xì)胞貼壁生長，呈梭形，伸展良好，見圖1。

Fig.1 Microscopic image of human gingival fibroblasts（×10）圖1 人牙齦成纖維細(xì)胞鏡下觀察（×10）

2.2 2種合金對HGF細(xì)胞增殖率的影響 與空白對照組相比，鈷鉻合金組抑制了HGF細(xì)胞的增殖，而鈦合金促進(jìn)了HGF細(xì)胞的增殖，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Effects of leaching solution of Co-Cr and Ti alloy on proliferation of human gingival fibroblasts表2 鈷鉻合金與鈦合金對HGF細(xì)胞增殖率的影響

2.3 2種合金對HGF細(xì)胞內(nèi)rGSH產(chǎn)生、TNF-α分泌及caspase-3基因表達(dá)的影響 與空白對照相比，鈷鉻合金組抑制了HGF細(xì)胞rGSH的產(chǎn)生（P＜0.05），促進(jìn)了HGF細(xì)胞TNF-α的分泌（P＜0.05），而鈦合金對HGF細(xì)胞rGSH產(chǎn)生、TNF-α分泌沒有明顯影響；鈷鉻合金組caspase-3的基因表達(dá)高于空白對照組（P＜0.05），而鈦合金對caspase-3基因表達(dá)無明顯影響，見表3。

Tab.3 Effects of leaching solution of Co-Cr and Ti alloy on rGSH，TNF-α production and caspase-3 mRNA expression of human gingival fibroblasts表32 種合金對HGF細(xì)胞rGSH產(chǎn)生、TNF-α分泌及caspase-3基因表達(dá)的影響（n=3，±s）

Tab.3 Effects of leaching solution of Co-Cr and Ti alloy on rGSH，TNF-α production and caspase-3 mRNA expression of human gingival fibroblasts表32 種合金對HGF細(xì)胞rGSH產(chǎn)生、TNF-α分泌及caspase-3基因表達(dá)的影響（n=3，±s）

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3 討論

鈷鉻合金具備貴金屬合金與非貴金屬合金的優(yōu)點(diǎn)，其可用于固定義齒修復(fù)，尤其是可摘局部義齒的支架，但鈷鉻合金的生物相容性有待觀察［4］。鈦合金的大量應(yīng)用是因?yàn)槠淠透g和良好的物理性能［5］。盡管牙科合金釋放的金屬離子不會造成全身系統(tǒng)性毒性，但合金與組織的緊密接觸會創(chuàng)造一個(gè)微環(huán)境，例如齦溝和支架區(qū)有較高的金屬離子濃度，因此，對于鈷鉻合金與鈦合金的細(xì)胞相容性評價(jià)是十分必要的。

HGF細(xì)胞是人牙齦結(jié)締組織和牙周膜中的主要細(xì)胞類型，在牙齒的發(fā)育、牙周組織的生理病理改變及牙周組織再生等方面具有重要作用［6］。MTT結(jié)果顯示，鈷鉻合金浸提液抑制了HGF細(xì)胞的增殖，而鈦合金浸提液促進(jìn)了細(xì)胞增殖，這一結(jié)果與al-Hiyasat等［7］的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)鈷鉻合金浸提液具有一定的細(xì)胞毒性?；钚匝酰≧OS）主要包括羥基自由基、超氧自由基和過氧化氫，過多的ROS所引起的氧化應(yīng)激，會導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，正常生理活動下ROS產(chǎn)生量很少，且可以被rGSH清除，rGSH是一種低分子清除劑，可以清除活性中間體或直接淬滅自由基等［8］。rGSH的產(chǎn)生量可以間接衡量ROS的產(chǎn)生量。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，鈷鉻合金組的rGSH量有所降低，表明鈷鉻合金誘導(dǎo)HSF細(xì)胞產(chǎn)生了較為顯著的ROS，引起了氧化應(yīng)激，而鈦合金組卻沒有導(dǎo)致rGSH的變化，表明其沒有引起細(xì)胞ROS的變化，細(xì)胞保持了正常的功能狀態(tài)。TNF-α是重要的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)，其還可介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［9］。與空白對照組相比，鈷鉻合金引起了TNF-α的顯著分泌，表明鈷鉻合金引起了較為顯著的免疫反應(yīng)，而鈦合金卻沒有引起TNF-α的增加。上述結(jié)果表明，鈷鉻合金具有一定的細(xì)胞毒性，進(jìn)一步在基因水平研究發(fā)現(xiàn)鈷鉻合金促進(jìn)了caspase-3的基因表達(dá)，而鈦合金對其表達(dá)沒有明顯影響。Caspase-3是caspases級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵效應(yīng)分子，caspase-3被激活后依次裂解細(xì)胞內(nèi)其他蛋白底物，最終會觸發(fā)細(xì)胞凋亡［10］。上述結(jié)果顯示，鈷鉻合金的細(xì)胞毒性可能是由于其激活了caspase-3基因的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡所引起。鈷鉻合金具有一定的細(xì)胞毒性，而鈦合金細(xì)胞相容性較好。

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（2014-07-23收稿 2015-01-09修回）

（本文編輯 李國琪）

The study of cytocompatibility of Co-Cr alloy and Ti alloy

YAN Tao
Department of Stomatology，Weifang People's Hospital，Shandong 261041，China

Objective To investigate the cytocompatibility of the liching liquids of Co-Cr alloy and Ti alloy on human gingival fibroblasts（HGF）.Methods The HGF were treated in vitro with leaching liquids of Co-Cr alloy and Ti alloy，respectively.The DMEM cell medium containing 10%fetal bovine serum was served as a negative control.The viability of HGF treated by two dental alloys were evaluated by means of MTT，and the contents of intracellular reduced glutathione （rGSH）were assayed by kits.The tumor necrosis factor-α（TNF-α）contents were determined in the culture supernatant by ELISA in two groups.The effects of these alloys on the expression of caspase-3 were examined by real time-PCR method.Results Compared with the control group，HGF treated with Co-Cr alloy leaching liquids showed a lower viability（P＜0.05），while Ti alloy leaching liquid promoted the proliferation of HGF.In Co-Cr alloy group，the rGSH content was significantly decreased（P＜0.05），while TNF-α content was significantly increased（P＜0.05）compared with control group.There were no significant differences in rGSH and TNF-α contents between the Ti alloy group and control group（P＞0.05）.The expression of caspase-3 was significantly higher in Co-Cr alloy group than that of control group（P＜0.05），while there was no significant difference in the expression of caspase-3 between Ti alloy group and control group.Conclusion Results suggest that Co-Cr alloy possesses cytotoxicity，while there is better cell compatibility for Ti alloy.

Chromium alloys；Titanium；glutathione；tumor necrosis factor-alpha；caspase 3；Co-Cr alloy；Ti alloy；human gingival fibroblast；cytocompatibility

R783.1

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.021

山東省濰坊市人民醫(yī)院牙科（郵編261041）

嚴(yán)濤（1971），男，主管技師，學(xué)士學(xué)位，主要從事口腔修復(fù)研究