苗瑞婧，張旭，孫迎春，高平

應用研究

磷酸化殼聚糖/無定形磷酸鈣復合物與多聚磷酸鈉對脫礦牙本質(zhì)仿生再礦化的影響

苗瑞婧，張旭，孫迎春，高平△

目的 探討磷酸化殼聚糖/無定形磷酸鈣（P-chi/ACP）與多聚磷酸鈉（TPP）對脫礦牙本質(zhì)體外仿生再礦化的影響，為深齲再礦化治療提供思路。方法 將32顆中度磨耗的離體磨牙制成大小相同的完全脫礦牙本質(zhì)片32個，其中2個樣品用于透射電鏡表征，另30個分成2組：P-chi/ACP+TPP組（n=15）經(jīng)TPP預處理后，固定在放置有P-chi/ACP的體外模型上；P-chi/ACP組（n=15）不經(jīng)過TPP處理。所有樣品根據(jù)是否與P-chi/ACP接觸分為實驗側與對照側。處理1周后，進行顯微計算機斷層掃描定量分析密度變化、透射電子顯微鏡定性分析微觀形態(tài)變化。結果 顯微計算機斷層掃描結果顯示P-chi/ACP+TPP組的實驗側灰度值高于對照側（125.42±12.16 vs 96.96±10.56，t= 7.124，P＜0.01），P-chi/ACP組中的實驗側灰度值高于對照側（119.39±8.64 vs 105.27±9.42，t=5.329，P＜0.01）。透射電子顯微鏡顯示P-chi/ACP+TPP組有纖維內(nèi)橫紋樣結構出現(xiàn)，提示脫礦牙本質(zhì)片實現(xiàn)了其主要成分Ⅰ型膠原的分級化纖維內(nèi)礦化；P-chi/ACP組未見橫紋樣結構。結論 單獨利用P-chi/ACP能夠提高脫礦牙本質(zhì)的密度，但共同利用TPP與P-chi/ACP復合物才能實現(xiàn)完全脫礦牙本質(zhì)的仿生再礦化。

牙本質(zhì)；仿生學；磷酸化殼聚糖；多聚磷酸鈉；再礦化

微創(chuàng)牙科（minimally invasive dentistry，MID）在治療深齲時往往進行間接蓋髓以促進軟化牙本質(zhì)的再礦化［1］。傳統(tǒng)的氟化物再礦化方法必須依賴殘余晶體，因此對于脫礦程度較大的牙本質(zhì)，再礦化效果不夠理想［2］。研究表明，利用聚丙烯酸［3］和多聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）［4］能夠使膠原纖維和部分脫礦牙本質(zhì)再礦化，但目前尚少有研究利用仿生材料對完全脫礦的牙本質(zhì)進行仿生再礦化。本研究利用具有良好生物相容性的磷酸化殼聚糖（phosphorylated chitosan，P-chi），研究新型仿生礦化材料對不含殘余晶體的完全脫礦牙本質(zhì)的再礦化效果，并利用體外模型模擬深齲結構，探索深齲底部軟化牙本質(zhì)的仿生再礦化治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料 因松動拔出的人中度磨耗離體磨牙共32顆（我院口腔頜面外科）。乙二胺四乙酸（EDTA）、殼聚糖、TPP、CaCl2·2H2O、Na2HPO4均購自上海生工生物工程股份有限公司。傅里葉變換紅外光譜儀（MAGNA-560，Nicolet，美國）、顯微計算機斷層掃描儀（1174-v2，Skyscane，比利時）、透射電子顯微鏡（JEM-2100F，JEOL，日本）、蠕動泵（BT/101S，雷弗，中國）。

1.2 方法

1.2.1 脫礦牙本質(zhì)片的制備 將32顆磨牙制成直徑為1 cm、厚度為1 mm的牙本質(zhì)片。在37℃恒溫搖床中，用0.5 mol/L EDTA溶液處理2周做成脫礦牙本質(zhì)片。選取其中2個樣品進行透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）表征。

1.2.2 磷酸化殼聚糖/無定形磷酸鈣復合物（P-chi/ACP）的制備 根據(jù)文獻［5］中的方法制備P-chi，將2.0 g殼聚糖與適量P2O5粉末加入20 mL甲基磷酸中，在0～5℃恒溫環(huán)境下攪拌3 h后，在-20℃冰箱中靜置24 h，取出后用甲醇沉淀，并通過離心收集，丙醇洗凈，離心3個循環(huán)后，通風櫥下風干，得到1.0～1.3 g P-chi。按照60 mmol/L Na2HPO4、50 g/L P-chi、100 mmol/L CaCl2·2H2O的先后順序和濃度配制溶液，攪拌至完全溶解。將孔徑1 cm的多孔板切割為孔高1 mm的模具，利用冷凍干燥技術制備出直徑1 cm，厚度1 mm的圓盤狀P-chi/ACP復合物。衰減全反射傅里葉變換紅外光譜儀（attenuated total internal reflectance，ATR-FTIR）、掃描電子顯微鏡及TEM對P-chi/ACP進行表征。

1.2.3 樣品分組 將余下30個牙本質(zhì)片均分為2組，A組：P-chi/ACP+TPP組；B組：P-chi/ACP組。A組樣品在脫礦處理后，浸泡于25 g/L TPP（pH=9.7）溶液中24 h。B組樣品不進行25 g/L TPP處理。ATR-FTIR分別對2組樣品進行表征。

1.2.4 體外再礦化模型的構建 建立體外再礦化模型，模擬深齲墊底環(huán)境，用離心管和滴管頂部制成雙層結構，分別模擬窩洞干燥的環(huán)境與牙髓腔的體液循環(huán)環(huán)境。采用蠟固定P-chi/ACP與牙本質(zhì)片。塑料隔離帽中央制備1個直徑為2 mm的圓孔，模擬牙本質(zhì)小管結構，模擬體液通過蠕動泵以10 mL/min的速度在下層循環(huán)，上層干燥，見圖1。采用劉燕等［3］的方法進行模擬體液配制。實驗進行1周之后取出樣品。

Fig.1 In vitro model of remineralization圖1 體外深齲模型示意圖

1.2.5 微型計算機斷層掃描（Micro-computed tomography，μCT）檢測 經(jīng)過1周的實驗處理后將樣品取出，用μCT對樣品進行非破壞性的三維掃描。利用CT-An軟件（Skyscane）將牙本質(zhì)片的掃描圖像進行三維重建、疊加后，分別采集每個樣品對照側與實驗側的灰度平均值。

1.2.6 TEM檢測 P-chi/ACP支架、2個脫礦牙本質(zhì)片與實驗處理后的30個牙本質(zhì)片，經(jīng)過固定、脫水、包埋和修塊后，切出100 nm厚的透射電鏡制件，于TEM下觀察超微結構，以判斷是否實現(xiàn)牙本質(zhì)膠原纖維內(nèi)分級再礦化。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗與方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，方差齊性，比較采用配對t檢驗，以雙側P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 牙本質(zhì)片的ATR-FTIR檢測結果 ATR-FTIR檢測EDTA脫礦后的牙本質(zhì)片，出現(xiàn)Ⅰ型膠原的特征峰，且未出現(xiàn)磷酸鈣晶體的特征峰，見圖2。牙本質(zhì)片經(jīng)過25 g/L TPP預處理后，出現(xiàn)磷酸特征峰，見圖3。提示牙本質(zhì)片經(jīng)過EDTA處理后為完全脫礦牙本質(zhì)，經(jīng)過25 g/L TPP處理后完全脫礦牙本質(zhì)片被磷酸化。

Fig.2 ATR-FTIR of dentin demineralized by EDTA圖2 牙本質(zhì)片經(jīng)EDTA脫礦處理后的ATR-FTIR結果

2.2 P-chi/ACP的ATR-FTIR檢測結果與TEM檢測結果 ATR-FTIR顯示P-chi/ACP具有PO的特征性波峰，且無磷酸鈣晶體的尖銳峰，見圖4，提示P-chi/ACP中無磷酸鈣晶體。TEM圖像顯示P-chi/ ACP的超微結構為納米球形顆粒，見圖5，提示Ca2+與PO離子結合為非晶相的無定形磷酸鈣顆粒。

Fig.3 ATR-FTIR of demineralized dentin treated by 25g/L TPP圖3 脫礦牙本質(zhì)片經(jīng)25g/L TPP處理后的ATR-FTIR結果

Fig.4 ATR-FTIR of P-chi/ACP圖4 P-chi/ACP復合物的ATR-FTIR結果

2.3 牙本質(zhì)片μCT檢測結果 2組牙本質(zhì)片實驗側的灰度值均高于對照側，見表1。分別從2組中選出1張典型的三維重構圖像，以分析灰度值增高的范圍及分布特征，見圖6。用Image J軟件對圖6中灰度值隨深度的變化趨勢進行繪圖，結果示2組中實驗側的灰度值均高于對照側，灰度值增高區(qū)域的深度達到距牙本質(zhì)片上表面0.7 mm以上，且隨著深度增加，灰度值有減小趨勢，見圖7。

Tab.1 Comparison of grey values of experimental and control sides between two groups表1 2組牙本質(zhì)片實驗側與對照側的灰度值比較

Fig.6 Three-dimension superimposed image of dentin disks圖6 牙本質(zhì)片縱截面三維重構疊加圖像

Fig.7 Image J analysis of reconstructed longitudinal sections of dentin disks圖7 牙本質(zhì)片縱截面三維重構圖像Image J分析圖

2.4 EDTA處理后的牙本質(zhì)片TEM檢測結果 EDTA處理后的牙本質(zhì)片主要結構為膨松的膠原纖維，見圖8。A組牙本質(zhì)片經(jīng)過1周再礦化處理后牙本質(zhì)膠原纖維排列致密，膠原纖維內(nèi)具有橫紋樣結構，提示牙本質(zhì)片實現(xiàn)了其主要成分Ⅰ型膠原的分級化纖維內(nèi)礦化，見圖9。B組牙本質(zhì)片經(jīng)過1周再礦化處理后牙本質(zhì)膠原纖維塌陷，條帶不清晰，纖維內(nèi)部僅觀察到窄細條紋，未出現(xiàn)纖維內(nèi)橫紋樣結構，提示未實現(xiàn)Ⅰ型膠原的分級化纖維內(nèi)礦化，見圖10。

3 討論

本研究ATR-FTIR結果顯示，經(jīng)脫礦處理后牙本質(zhì)的主要成分為Ⅰ型膠原，說明牙本質(zhì)片已被完全脫礦，不含無機成分及殘余晶體。在掃描參數(shù)一致的條件下，μCT掃描后的三維重建圖像中，灰度值與實際礦物質(zhì)密度為線性關系，灰度值越高代表礦物質(zhì)密度越高［6］。本研究μCT掃描結果顯示，2組實驗側灰度值均高于對照側，提示利用P-chi/ACP可以實現(xiàn)脫礦牙本質(zhì)片礦物質(zhì)密度的增加。由典型的三維重建圖像分析中可見，2組樣品礦物質(zhì)密度增高區(qū)域的深度可達到0.7 mm以上，說明材料可以透過表面滲入到牙本質(zhì)片的深層，具有應用于深齲底部軟化牙本質(zhì)再礦化治療的潛力。

TEM圖像中顯示P-chi/ACP微觀結構為納米球形顆粒。P-chi是一種多聚電解質(zhì)，能夠將Ca2+與PO離子包裹形成無定形的納米磷酸鈣亞穩(wěn)定結構，成為礦化提供結晶來源。研究表明，牙本質(zhì)膠原帶正電荷，具有周期性的結構，有空隙區(qū)和重疊區(qū)，能通過靜電作用吸引帶負電的ACP納米球，ACP進一步成核、生長，使牙本質(zhì)膠原實現(xiàn)再礦化［7］。晶體結晶理論是指導膠原仿生礦化方法研究的重要基礎理論之一［8］，非經(jīng)典的結晶理論中，多聚電解質(zhì)將離子穩(wěn)定為無定形的初始粒子。本研究中的P-chi材料具有將Ca2+與PO離子穩(wěn)定為無定形磷酸鈣的粒子，是牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白 1（dentin matrix protein，DMP1）的仿生物，與Dai等［9］利用聚丙烯酸（PAA）將Ca2+與PO組裝成了無定形納米磷酸鈣，從而礦化膠原組織的研究結果一致。

2 組樣品經(jīng)處理后的礦物質(zhì)密度均有所增加，微觀結構也有所差異。TEM圖像中，A組出現(xiàn)纖維內(nèi)橫紋樣結構，B組膠原纖維塌陷，說明A組樣品的超微結構更接近于自然礦化組織，與Tay等［10］的研究結果一致。牙本質(zhì)的再礦化不僅在于密度的增加，更重要的是要實現(xiàn)接近自然礦化組織的分級結構，從而提高其機械性能，因此A組較B組更好地實現(xiàn)了仿生再礦化。

推測在TPP的作用下，2組礦化的機制不同。A組樣品在TPP堿性溶液處理的條件下，膠原表面的氨基酸缺乏正電荷，與帶負電荷的ACP粒子不能主動相互吸引。A組中完全脫礦的牙本質(zhì)片在經(jīng)過TPP處理后，ATR-FTIR結果顯示出現(xiàn)PO3/P-O-P的特征峰，說明牙本質(zhì)膠原發(fā)生了磷酸化。研究表明，TPP能夠與膠原分子中空隙區(qū)的氨基酸離子交聯(lián)，有利于進一步螯合ACP納米球中的鈣離子，最終形成纖維內(nèi)的分級再礦化［11］。未經(jīng)TPP處理的膠原纖維中，隨著ACP納米球的不斷沉積，靜電勢能逐漸縮小，在空隙區(qū)和重疊區(qū)的每個礦化帶微晶分布逐漸均勻，形成的分級結構不明顯［9］。

以往研究多采用部分脫礦的牙本質(zhì)、Ⅰ型膠原凍干粉，本研究樣品來自人離體磨牙，更接近于向臨床醫(yī)學的轉化。深齲墊底再礦化的體外模型的建立，可應用于更多的牙本質(zhì)再礦化體外研究與深齲治療的實驗研究。本研究中采用的P-chi生物相容性較好，已廣泛使用于醫(yī)藥研究，較以往使用較多的PAA具有更良好的生物相容性。雖然P-chi/ACP復合物尚不能直接應用于臨床，但本實驗已經(jīng)證實完全脫礦的牙本質(zhì)膠原能夠在P-chi/ACP支架的作用下實現(xiàn)礦物質(zhì)含量的增加和纖維內(nèi)的分級再礦化，但其缺點為不易保持形態(tài)穩(wěn)定，今后的研究可以致力于提高材料的親水性及耐久性，并能建立ACP納米顆粒的緩釋系統(tǒng)。

（圖5、8～10見插頁）

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（2014-11-20收稿 2014-12-30修回）

（本文編輯 閆娟）

In vitro biomimetic remineralization of dentin collagen by phosphorylated chitosan/amorphous calcium phosphate compound and tripolyphosphate

MIAO Ruijing，ZHANG Xu，SUN Yingchun，GAO Ping△
Stomatological Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
△Corresponding Author E-mail：Gaoping@tmu.edu.cn

Objective To investigate the remineralizing therapy of deep caries and in vitro biomimetic remineralization of demineralized dentin by phosphorylated chitosan/amorphous calcium phosphate compound（P-chi/ACP）and tripolyphosphate（TPP）.Methods Thirty-two extracted human molars were cut and completely demineralized.Two samples were used to show the characteristics by transmission electron microscopy（TEM）.The other 30 samples were divided into two groups: fifteen samples were treated by P-chi/ACP and TPP（P-chi/ACP+TPP group），the other fifteen samples were not treated by TPP（P-chi/ACP group）.All of the samples were distinguished into experimental side and control side，and then they were set on the in vitro model for 1 week.Micro-computed tomography（μCT）and TEM were used to assess the effects of remineralization.Results μCT detection revealed that the mineral density were higher in the experimental sides（125.42±12.16 and 119.39±8.64）than that of control sides（96.96±10.56 and 105.27±9.42）in both groups（P＜0.01）.TEM figures showed that hierarchical intrafibrillar remineralization was realized in samples of P-chi/ACP+TPP group，while trace amounts of hierarchical remineralization was detected in P-chi/ACP group.Conclusion Fully demineralized dentin appears to have the potential to be remineralized with the application of P-chi/ACP.The ultrastructure of samples is better in P-chi/ACP+TPP group than that of P-chi/ACP group.

dentin；bionics；phosphorylated chitosan；sodium tripolyphosphate；remineralization

R781.1；R318.08

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.019

國家自然科學基金青年項目（81200817）；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃青年項目（12JCQNJC09200）

天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院（郵編300070）

苗瑞婧（1989），女，碩士在讀，主要從事口腔材料研究

△E-mail：Gaoping@tmu.edu.cn