王勇，王曉東，陳文捷，于兆進(jìn)，吳慧哲，趙琳，魏敏杰△

散發(fā)性乳腺癌中DNMT3a、DNMT3b表達(dá)與ERα基因啟動子甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)的關(guān)系

王勇1，王曉東2，陳文捷2，于兆進(jìn)2，吳慧哲2，趙琳2，魏敏杰2△

目的 探討散發(fā)性乳腺癌中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）3a、DNMT3b蛋白表達(dá)情況及其與雌激素受體（ER）α基因啟動子甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)的關(guān)系。方法 選取180例散發(fā)性乳腺癌與30例乳腺纖維腺瘤組織，采用免疫組化法檢測組織中DNMT3a、DNMT3b蛋白的表達(dá)情況，甲基化特異性PCR檢測97例散發(fā)性乳腺癌中ERα基因啟動子的甲基化狀態(tài)。結(jié)果 乳腺纖維腺瘤與乳腺癌組織中的DNMT3a、DNMT3b蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌組織的DNMT3a、DNMT3b水平高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的DNMT3a表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（均P＜0.05）；97例乳腺癌中有39例（40.2%）發(fā)生ERα基因啟動子甲基化，DNMT3a蛋白陽性表達(dá)與ERα基因甲基化呈正相關(guān)（rs=0.250）；DNMT3a蛋白表達(dá)對患者的總體生存期（OS）有顯著影響（P=0.035），對無病生存期（DFS）無明顯影響（P=0.064），DNMT3b蛋白表達(dá)對患者的OS和DFS無影響（P分別為0.914、0.961）。結(jié)論DNMT3a、DNMT3b陽性表達(dá)與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移、病程進(jìn)展、預(yù)后相關(guān)；DNMT3a與ERα基因啟動子甲基化狀態(tài)呈正相關(guān)；抑制DNMT3a、DNMT3b蛋白可能有利于散發(fā)性乳腺癌的預(yù)防和治療。

散發(fā)性乳腺癌；DNMT3a；DNMT3b；ERα；DNA甲基化；啟動區(qū)（遺傳學(xué)）

DNA甲基化是一個基因表達(dá)控制過程中的表觀遺傳標(biāo)記，DNA甲基化修飾是最常見的表觀遺傳學(xué)改變方式之一，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferases，DNMTs）催化完成，在功能上等同于遺傳改變，可逆轉(zhuǎn)導(dǎo)致基因沉默。DNMTs家族中的DNMT3a和 DNMT3b參與 DNA從頭甲基化［1］，DNMT3a、DNMT3b蛋白在多種惡性腫瘤如肝癌、肺癌、胃癌中過表達(dá)［2-4］。雌激素及雌激素受體（ER）α在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用［5］。ERα是乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物的重要靶點，ERα失表達(dá)可導(dǎo)致乳腺癌對此類藥物耐受［6］。對散發(fā)性乳腺癌組織的研究表明，DNA甲基化可造成ERα蛋白失表達(dá)［7-8］。國內(nèi)有關(guān)乳腺癌與DNMT3a、DNMT3b及ERα基因啟動子甲基化的相關(guān)研究較少。本研究旨在研究DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)、ERα基因甲基化、ERα蛋白表達(dá)對散發(fā)性乳腺癌預(yù)后的影響，為闡明DNMT3a、DNMT3b蛋白在散發(fā)性乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科2004—2014年收治的散發(fā)性乳腺腫瘤患者210例，其中乳腺癌180例，乳腺纖維腺瘤30例。180例乳腺癌患者中，導(dǎo)管癌162例，小葉癌13例，其他類型癌（黏液癌、髓樣癌、篩狀癌）5例。乳腺癌患者年齡27～89歲，平均（50.74±10.37）歲?；颊咝g(shù)前均未接受放療或化療。178例術(shù)前檢測了ERα蛋白的表達(dá)水平，82例ERα蛋白表達(dá)陽性（46.1%）。

1.2 主要試劑 兔抗人DNMT3a、DNMT3b多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology，UltraSensitiveTMS-P超敏濃縮試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（LI-9032/9033）。

1.3 免疫組化法檢測乳腺組織中DNMT3a、DNMT3b的表達(dá) 取乳腺癌和乳腺纖維腺瘤組織標(biāo)本，經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋，切成厚4 μm的切片，固定在載玻片（經(jīng)多聚賴氨酸處理）上，二甲苯脫蠟，降梯度乙醇脫苯、水化。將切片浸入pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液，80 kPa高壓修復(fù)10 min。切片經(jīng)3%過氧化氫/甲醇，37℃孵育30 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，并用10%非免疫性正常山羊血清37℃孵育30 min封閉組織膠原位點。切片滴加DNMT3a、DNMT3b多克隆抗體（DNMT3a1∶200稀釋；DNMT3b1∶100稀釋），4℃孵育過夜，Western blot分析驗證抗體特異性。次日切片滴加生物素標(biāo)記的二抗（1∶200稀釋），37℃孵育30 min，再滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-辣根過氧化酶（S-P）復(fù)合物，37℃孵育30 min。切片經(jīng)PBS浸洗后滴加新鮮配制的3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，觀察。同步采用PBS液代替DNMT3a、DNMT3b抗體作陰性對照，其他步驟不變。

DNMTs蛋白細(xì)胞核表達(dá)視為陽性表達(dá)。由2位有經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)生對染色結(jié)果進(jìn)行盲法評價。結(jié)果評定采用Allred score積分［9］，指腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞百分比計分（陰性計為0，＜1%計為1，≤1%～10%計為2，＜10%～33%計為3，＜33%～66%計為4，＞66%計為5）與染色強(qiáng)度計分（無染色計為0、弱陽性計為1、中等強(qiáng)度計為2、強(qiáng)陽性計為3）之和，范圍0～8分?？偡帧?計為陰性，＞2計為陽性。

1.4 甲基化特異性PCR法檢測乳腺癌組織ERα基因啟動子甲基化狀態(tài) 提取的DNA經(jīng)檢測光密度（OD）值發(fā)現(xiàn)只有97例組織DNA濃度能夠達(dá)到甲基化特異性PCR的要求，提取97例癌組織標(biāo)本總DNA，溶于50 μL TE緩沖液（Tris和EDTA配制而成），紫外分光光度計測定OD260和OD280，計算DNA濃度，以50 μL超輕水（DDW）溶解1 μgDNA，采用亞硫酸鹽和Wizard微型柱修飾并純化總DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見表1。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，其間加入rTaq DNA聚合酶；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s，38個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠，100 V，70 mA電泳30 min后，0.1%溴化乙錠染色15 min，凝膠成像系統(tǒng)照相分析。采用SssI甲基化酶修飾的人外周血淋巴細(xì)胞基因組DNA作為甲基化特異性PCR擴(kuò)增陽性對照模板，以去離子水作為空白對照。

Tab.1 Primers used for methylated（M）and unmethylated（U）sequences in ERα MSP表1 ERα甲基化（M）和非甲基化（U）引物表

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同組別間蛋白表達(dá)水平比較采用χ2檢驗，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)，采用Log-rank分析DNMT3a、DNMT3b、ERα基因甲基化、ERα蛋白表達(dá)與散發(fā)性乳腺癌預(yù)后的關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNMT3a、DNMT3b蛋白在散發(fā)性乳腺癌組織中的表達(dá)情況 2組的DNMT3a、DNMT3b蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2、圖1。

Tab.2 DNMT3a and DNMT3b expressions in breast cancer and breast fibroadenoma表2 DNMT3a、DNMT3b蛋白在乳腺癌和乳腺纖維腺瘤組織中的表達(dá) 例（%）

Fig.1 Immunohistochemical staining of DNMT3a and DNMT3b proteins in breast fibroadenoma and breast cancer（×400）圖1 DNMT3a、DNMT3b蛋白在乳腺纖維腺瘤和乳腺癌中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

2.2 DNMT3a、DNMT3b蛋白與乳腺癌患者臨床病理資料的關(guān)系 Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌組織的DNMT3a、DNMT3b水平高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的DNMT3a表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（均P＜0.05），DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、腫瘤類型以及組織學(xué)分級無明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05），見表3。

2.3 乳腺癌組織中 ERα基因啟動子甲基化狀態(tài) 97例中有39例（40.2%）發(fā)生ERα基因啟動子甲基化，58例（59.8%）未發(fā)生ERα基因啟動子甲基化，見圖2。

2.4 DNMT3a、DNMT3b與ERα基因甲基化及蛋白表達(dá)的相關(guān)性 DNMT3a陽性表達(dá)與ERα基因啟動子區(qū)甲基化呈正相關(guān)，與ERα蛋白表達(dá)不相關(guān)；DNMT3b陽性表達(dá)和ERα基因啟動子區(qū)甲基化、ERα蛋白表達(dá)均不相關(guān)，見表4。

2.5 DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)與散發(fā)性乳腺癌預(yù)后的關(guān)系 檢測DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)的180例患者中138例患者的總體生存期（OS）和無病生存期（DFS）資料完整，生存分析顯示，DNMT3a蛋白表達(dá)對患者的OS有顯著影響（P=0.035），對DFS無明顯影響（P=0.064），DNMT3b蛋白表達(dá)對患者的OS和DFS均無影響（P分別為0.914、0.961），見圖3。

2.6 ERα基因甲基化與散發(fā)性乳腺癌預(yù)后的關(guān)系 檢測ERα基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的97例患者中66例的OS和DFS資料完整，其中ERα基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化23例，未甲基化43例，log-rank分析顯示ERα基因啟動子區(qū)甲基化狀對患者的OS和DFS均無明顯影響（P分別為0.971、0.951），見圖4。

Tab.3 Association of DNMT3a，DNMT3b expressions with clinicopathological features of breast cancer表3 DNMT3a、DNMT3b表達(dá)和乳腺癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系 例（%）

Fig.2 Detecting of the state of promoter methylation of ERα gene圖2 患者ERα基因啟動子甲基化

Tab.4 Association of DNMT3a，DNMT3b expressions with ERα protein expression and ERα gene methylation status表4 DNMT3a、DNMT3b表達(dá)和ERα基因甲基化及ERα蛋白表達(dá)的相關(guān)性 （rs）

Fig.3 The association of DNMT3a，3b proteins expression with OS and DFS of sporadic breast cancer圖3 DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)與散發(fā)性乳腺癌OS和DFS的關(guān)系

2.7 ERα蛋白與散發(fā)性乳腺癌預(yù)后的關(guān)系 178例乳腺癌患者檢測了ERα蛋白表達(dá)水平，其中生存資料完整者136例。結(jié)果表明ERα蛋白表達(dá)對患者的OS和DFS無明顯影響（P分別為0.676、0.828），見圖5。

3 討論

多種惡性腫瘤中均有DNMTs蛋白表達(dá)水平升高，但在乳腺癌的相關(guān)研究中，僅有報道顯示DNMTs mRNA水平增高［10］，尚缺少關(guān)于DNMTs蛋白水平的報道。Ben等［11］研究證實DNMT3a、DNMT3b蛋白的表達(dá)水平在散發(fā)性乳腺癌患者中增高。本研究檢測了180例散發(fā)性乳腺癌和30例乳腺纖維腺瘤的組織樣本中DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示乳腺癌組織中DNMT3a、DNMT3b的陽性表達(dá)比例數(shù)值上雖然高于乳腺纖維腺瘤，但差異無統(tǒng)計學(xué)差異，考慮可能是樣本例數(shù)較小所致。

Fig.4 The association of ERα gene methylation with OS and DFS of sporadic breast cancer圖4 ERα基因甲基化與散發(fā)性乳腺癌OS（A）和DFS（B）的關(guān)系

Fig.5 The association of ERα protein expression with OS and DFS of sporadic breast cancer圖5 ERα蛋白與散發(fā)性乳腺癌OS（A）和DFS（B）的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)DNMT3a、DNMT3b表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及 TNM分期有關(guān)，生存分析顯示DNMT3a蛋白表達(dá)對患者的OS有顯著影響，提示DNMT3a參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，DNMT3a、DNMT3b高表達(dá)與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移、病程進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)。研究亦證實，DNMTs的過表達(dá)可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中抑癌基因的高甲基化而失表達(dá)［12］。本研究檢測了乳腺癌患者ERα基因啟動子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)DNMT3a表達(dá)水平與ERα基因甲基化水平顯著正相關(guān)，而與ERα蛋白表達(dá)水平不相關(guān)。

本研究進(jìn)一步分析了ERα基因啟動子區(qū)甲基化以及蛋白表達(dá)對患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示二者對患者OS、DFS均無顯著影響。但已有的報道多顯示ERα蛋白失表達(dá)與患者的預(yù)后不良有關(guān)［13］。本研究并未得到類似的結(jié)果，可能與本研究樣本量較小有關(guān)，進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行研究可能會得到有意義的結(jié)果。

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（2014-10-21收稿 2014-12-15修回）

（本文編輯 閆娟）

The association of DNMT3a，DNMT3b expression with the state of promoter methylation of ERα gene and ERα expression in sporadic breast cancer

WANG Yong1，WANG Xiaodong2，CHEN Wenjie2，YU Zhaojin2，WU Huizhe2，ZHAO Lin2，WEI Minjie2△
1 Department of Pharmacology，China Medical University，Shenyang 110013，China；2 Department of Pharmacology，The Pharmaceutical School of China Medical University
△Corresponding Author E-mail:mjwei@hotmail.com

Objective To investigate the correlationship between DNMT3a，DNMT3b protein expressions and the state of promoter methylation of ERα gene and ERα protein expression in the development of sporadic breast cancer.Methods A total of 180 patients with sporadic breast cancer and 30 patients with breast fibroadenoma were included in this study.The expressions of DNMT3a and DNMT3b protein were detected by immunohistochemical method.The state of promoter methylation of ERα gene was detected by methylation specific PCR in 97 patients with sporadic breast cancer.Results There were no significant differences in positive expression rates of DNMT3a and DNMT3b protein between breast fibroadenoma and breast cancer.There were higher expression levels of DNMT3a and DNMT3b in breast cancer patient ofⅢ～Ⅳstages than those ofⅠ～Ⅱstages.The expression of DNMT3a was significantly higher in patients with lymph node metastasis than that of patients without lymph node metastasis（P＜0.05）.Of 97 cases of breast cancer patients，ERα gene promoter methylation occurred in 39 cases（40.2%）.The positive expression of DNMT3a protein was positively correlated with the ERα gene methylation（rS=0.250）.The DNMT3a protein expression showed a significant influence to the overall survival（OS）in patients of breast cancer（P=0.035），no significant influence to the disease-free survival（DFS）（P=0.064）.DNMT3b protein expression showed no significant influence to OS and DFS of patients with breast cancer（P=0.914 and 0.961）.Conclusion The positive expressions of DNMT3a and DNMT3b are correlated with the invasion，metastasis and poor prognosis of sporadic breast cancer.DNMT3a was positively correlated with the state of ERα gene promoter methylation.The inhibition of DNMT3a and DNMT3b may have advantages in the prevention and treatment of sporadic breast cancer.

sporadic breast cancer；DNMT3a；DNMT3b；ERα；DNA methylation；promoter regions（genetics）

R737.9

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.014

遼寧省高校創(chuàng)新團(tuán)隊支持計劃資助項目（LT2014016）

1中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院辦公室（郵編110013）；2中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室

王勇（1980），男，碩士，主要從事分子腫瘤藥理學(xué)研究

△E-mail:mjwei@hotmail.com