何學(xué)恕，莫新玲，陳華，謝婷

PPARγ對大鼠心肌缺血/再灌注后惡性心律失常的影響

何學(xué)恕，莫新玲△，陳華，謝婷

目的 探討大鼠心肌過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ對缺血/再灌注（I/R）后惡性心律失常的影響。方法 24只SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（Sham組），缺血/再灌注組（I/R組），羅格列酮+缺血/再灌注組（ROS組），PPARγ抑制劑GW9662+缺血/再灌注組（GW組），每組6只。采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法制造I/R動物模型，缺血30 min，再灌注2 h。全程肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖觀察各組惡性心律失常發(fā)生次數(shù)并記錄校正QT間期（QTc）的變化，RT-PCR檢測PPARγ mRNA表達(dá)。結(jié)果 ROS組發(fā)生5例惡性心律失常，I/R組2例，GW組1例，Sham組0例。ROS組的QTc間期在再灌注期較其他3組延長（均P＜0.05），與I/R組和ROS組相比，GW組的QTc間期在缺血30 min及再灌注過程中縮短（均P＜0.05）。與Sham組相比，其他3組PPAR-γ mRNA表達(dá)明顯升高（均P＜0.05），ROS組PPARγ mRNA表達(dá)水平最高，GW組較I/R組和ROS組表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05）。結(jié)論 PPARγ過表達(dá)可能導(dǎo)致心肌I/R惡性心律失常的發(fā)生。

PPARγ；心肌；再灌注損傷；心律失常；羅格列酮

心肌缺血/再灌注（I/R）損傷是指心肌在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血供后，結(jié)構(gòu)功能損傷及代謝障礙加重的現(xiàn)象，再灌注心律失常是其常見并發(fā)癥之一［1］。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ是一種依賴配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，其在心肌的表達(dá)量是血管壁的5倍［2］。噻唑烷二酮類藥物是PPARγ合成配體，研究顯示其對缺血心肌有保護(hù)作用［3-4］。目前關(guān)于心肌PPARγ過表達(dá)對缺血/再灌注惡性心律失常的影響如何報(bào)道較少。本研究擬通過觀察大鼠心肌組織PPARγ表達(dá)的變化對缺血/再灌注心律失常的影響，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 羅格列酮及PPARγ抑制劑GW9662、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，超純RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，DNA Marker購自杭州碧云天，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。BL-420F生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購自成都泰盟科技公司，電腦動物呼吸機(jī)購自江西特力公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 SPF級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量235～255 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：Sham組（開胸后冠脈左前降支只穿線，不結(jié)扎）；I/R組（結(jié)扎冠脈左前降支缺血30 min，再灌注120 min）；羅格列酮+缺血/再灌注（ROS）組（術(shù)前腹腔注射羅格列酮6 mg/kg，以后操作同I/R組）；GW9662+缺血/再灌注（GW）組（術(shù)前GW9662腹腔注射4 mg/kg，以后操作同I/R組）。每組6只。

1.3 建模 術(shù)前大鼠經(jīng)10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，BL-420F生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)心電監(jiān)測。氣管切開插管，人工呼吸機(jī)輔助通氣，頻率62次/min，吸呼比1.5∶1。胸部去毛消毒后開胸，以6號帶線細(xì)針在冠狀動脈根部下1～2 mm、肺動脈和左心耳之間穿過，中間墊一硬質(zhì)海綿條，止血鉗夾緊胸壁創(chuàng)口，觀察心電圖變化；心電圖ST段抬高判斷為結(jié)扎成功。30 min后松止血鉗，拔出硬質(zhì)海綿條，再灌注2 h。結(jié)束后迅速剪下心臟，在心室前壁相同位置留取心肌組織液氮冷凍。

1.4 心電圖觀察 記錄各組缺血/再灌后出現(xiàn)惡性心律失常（室性心動過速、室顫）的例數(shù)，比較各組發(fā)生率。采用Bazett公式計(jì)算心率校正QT間期（QTc），QTc=QT/（RR）1/2，以P-R間期水平為基線，從QRS起點(diǎn)與T波終點(diǎn)之間距離為QT間期，每個時間點(diǎn)測6個波形，取平均值，分別觀察術(shù)前開始時，缺血15 min、30 min，再灌注拆線1 h、2 h時QTc間期變化。

1.5 RT-PCR檢測PPARγ mRNA表達(dá) 取各組大鼠心肌組織，提取總RNA并測定濃度。取5 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR反應(yīng)。引物序列如下：PPARγ上游 5′-TGGACCTCTCTGTGATGG-3′，下游5′-CGCACTTTGGTATTCT TG-3′，產(chǎn)物長度173 bp；內(nèi)參GAPDH上游5′-TACCCACGGCAAGTTCAACG-3′，下游5′-CACCAGCATCACCCCATTT G-3′，產(chǎn)物長度122 bp。反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，54℃45 s，30個循環(huán)；72℃5 min。4組樣品同時擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各擴(kuò)增帶吸光度值，以目的基因與GAPDH吸光度比值計(jì)算相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，總體變化趨勢比較采用析因方差分析，組內(nèi)不同時間點(diǎn)比較、同一時間點(diǎn)不同組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心電圖的變化 Sham組無惡性心律失常發(fā)生，I/R組出現(xiàn)2例，GW組1例，ROS組5例。同組大鼠QTc間期在5個時間點(diǎn)的變化趨勢不全相同（F=45.226，P＜0.01），同一時間點(diǎn)4組大鼠間不全相同（F=45.594，P＜0.01），時間與處理因素有交互作用（F=24.916，P＜0.01），即4組大鼠心電圖QTc間期在5個時間點(diǎn)的變化趨勢不全相同。I/R組與ROS組大鼠QTc間期在缺血30 min、再灌注1 h、再灌注2 h時均高于Sham組，GW組大鼠QTc間期在再灌注期均低于ROS組和I/R組（均P＜0.05）；4組間大鼠QTc間期在術(shù)前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1 Comparison of QTc interval of ECG between four groups表1 各組大鼠心電圖QTc間期的比較（ms，±s）

Tab.1 Comparison of QTc interval of ECG between four groups表1 各組大鼠心電圖QTc間期的比較（ms，±s）

＊＊P＜0.01；組間比較：A與Sham組比較，B與I/R組比較，C與ROS組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：a與術(shù)前比較，b與缺血15 min比較，c與缺血30 min比較，P＜0.05；ROS組再灌注1 h時n=5，2 h時n=4，其余時間點(diǎn)n=6，其余3組各時間點(diǎn)n=6。

組別Sham組I/R組ROS組GW組F術(shù)前83.83±3.25 82.33±2.88 83.00±3.69 82.67±3.93 0.208缺血15 min 87.50±3.08 97.67±3.33a69.83±4.22Ba90.00±2.28BCa76.350＊＊缺血30 min 86.33±6.31 103.17±10.17Aa111.17±5.31Aa93.83±2.79BCa15.716＊＊組別Sham組I/R組ROS組GW組F再灌注1 h 84.33±2.66 94.67±5.24Aac102.60±4.62ABabc77.50±5.24BCb32.687＊＊再灌注2 h 84.83±2.40 101.00±3.85Aa106.75±4.57ABab84.17±3.43BCb53.700＊＊F 0.947 12.158＊＊86.534＊＊9.333＊＊

2.2 各組PPARγ mRNA表達(dá)比較 各組PPARγ mRNA相對表達(dá)量分別為Sham組0.155±0.047，I/R 組0.485±0.048，ROS組0.672±0.064，GW組0.293± 0.046，4組間表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=104.181，P＜0.05）。與Sham組比較，其他3組PPARγ mRNA表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05）。ROS組PPARγ mRNA表達(dá)量明顯高于其他3組，GW組較I/R組和ROS組PPARγ mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Expressions of PPARγ mRNA in four groups圖1 各組PPARγ mRNA表達(dá)水平

3 討論

PPARs屬于核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子，有α、β、γ 3種亞型。人PPARγ基因定位于3p25，其在一系列病理和生理過程中發(fā)揮重要作用［5］。PPARγ激動劑羅格列酮、吡格列酮等能促進(jìn)其表達(dá)。陳文雁等［6］發(fā)現(xiàn)PPARγ1過表達(dá)對大鼠心肌有保護(hù)作用。而Loebstein等［7］發(fā)現(xiàn)長期采用羅格列酮治療的2型糖尿病患者心血管風(fēng)險(xiǎn)事件增加。Palee等［8］研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮能增加缺血/再灌注后的室顫傾向。本研究發(fā)現(xiàn)ROS組大鼠較其他組大鼠更易出現(xiàn)心律失常，具體表現(xiàn)為室速持續(xù)次數(shù)、時間增加，短期改變明顯，室顫增加及室顫發(fā)作時間縮短，且2只大鼠死于再灌注過程；ROS組大鼠再灌注1 h、2 h時心電圖QTc間期延長較其他組顯著，與國外文獻(xiàn)報(bào)道相似［8-9］。

正常情況下心肌低表達(dá)PPARγ。Lee等［10］研究表明PPARγ在糖尿病相關(guān)的心臟疾病中表達(dá)升高。Morrow等［9］研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮預(yù)處理轉(zhuǎn)基因模型小鼠PPARγ過表達(dá)可增加室性心律失常發(fā)生率。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血/再灌注模型大鼠PPARγ表達(dá)上調(diào)，羅格列酮預(yù)處理后進(jìn)一步促進(jìn)PPARγ表達(dá)。ROS組大鼠再灌2 h后QTc間期較其他組顯著延長，可能與心室復(fù)極受損有關(guān)。而使用PPARγ抑制劑GW9662干預(yù)后，惡性心律失常發(fā)生率明顯減低，較I/R組及ROS組PPARγ表達(dá)下調(diào)，推測PPARγ可能介導(dǎo)了再灌注心律失常。過高的PPARγ表達(dá)可能會使心肌細(xì)胞脂質(zhì)異常蓄積和心肌電生理發(fā)生重構(gòu)，而心肌細(xì)胞動作電位的復(fù)極相依賴于鈉離子和鈣離子去極化與鉀離子復(fù)極化的平衡，正常心律的發(fā)生基于鈉、鉀、鈣離子通道的正常開放關(guān)閉；心肌細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和心肌電重構(gòu)影響正常離子通道的開放和關(guān)閉，尤其是鉀離子通道開放減緩甚至減少，引起動作電位時相延長，從而導(dǎo)致心室除極和復(fù)極異常，心電圖表現(xiàn)為室性心律失常。本研究也存在不足之處，未進(jìn)行大鼠心肌電生理研究，無法檢測離子通道的變化過程。

［1］Wang L，Duan-Mu LJ，Jiao L，et al.Changes in myocardial action potential of rabbit with myocardial ischemia exposed to repeated positive acceleration（+Gz）［J］.Med J Chin PLA，2014，39（7）:581-585.［王蘭，端木魯健，焦琳，等.反復(fù)正加速度暴露致兔缺血心肌動作電位變化的研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2014，39（7）:581-585］.

［2］Mehrabi MR，Thalhammer T，Haslmayer P，et al.The peroxisome proliferator-activated receptor gamma（PPARgamma）is highly expressed inhuman heart ventricles［J］.Biomed Pharmacother，2002，56（8）:407-410.doi:10.1016/S0753-3322（02）00251-2.

［3］Wang H，Ye P，Li Y，et al.Effects of Pioglitazone on TGFβ1 expression in ischemia/reperfusion injury myocardial of rats［J］.Chinese Journal of Applied Physiology，2013，29（1）:1-4.［王浩，葉平，李泱，等.吡格列酮對大鼠缺血/再灌注心肌轉(zhuǎn)化生長因子表達(dá)的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2013，29（1）:1-4］.

［4］Zhu QW，Wang H，Zhang LY，et al.Effects of Pioglitazone on hypoxia/reoxygenation injury and protein kinase C expression in neonatal cardiomyocytess［J］.J South Med Univ，2011，31（11）:1819-1823.［朱啟偉，王浩，張令堯，等.吡格列酮對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及對蛋白激酶C表達(dá)的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（11）:1819-1823］.

［5］He W.PPARγ2 polymorphism and human health［R］.PPAR Res，2009，2009:849538.doi:10.1155/2009/849538.

［6］Chen WY，Wei L，Kong GY，et al.Effects of over-expression of PPARγ gamma 1 gene on the changes of myocardial infract areas and inflammatory response induced by ischemia reperfusion［J］.China Journal of Modern Medicine，2013，23（34）:30-35.［陳文雁，魏來，孔高茵，等.過表達(dá)PPARγ1基因?qū)Υ笫笮募∪毖俟嘧⒑笮墓Ｃ娣e和炎癥反應(yīng)的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23 （34）:30-35］.

［7］Loebstein R，Dushinat M，Vesterman-Landes J，et al.Database evaluation of the effects of long-term rosiglitazone treatment on cardiovascular outcomes in patients with type 2 diabetes［J］.J Clin Pharmacol，2011，51（2）:173-180.doi:10.1177/009127 00103682 81.

［8］Palee S，Weerateerangkul P，Surinkeaw S，et al.Effect of rosiglitazone on cardiac electrophysiology infarct size and mitochondri-al function in ischaemia and reperfusion of swine and rat heart［J］.Exp Physiol，2011，96（8）:778-789.doi:10.1113/expphysiol.2011.057885.

［9］Morrow JP，Katchman A，Son NH，et al.Mice with cardiac overexpression of peroxisome proliferator-activated receptor γ have impaired repolarization and spontaneous fatal ventricular arrhythmias［J］.Circulation，2011，124（25）:2812-2821.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.111.056309.

［10］Lee TI，Kao YH，Chen YC，et al.Oxidative stress and inflammation modulate peroxisome proliferator-activated receptors with regional discrepancy in diabetic heart［J］.Eur J Clin Invest，2010，40（8）: 692-699.doi:10.1111/j.1365-2362.2010.02318.x.

（2014-10-28收稿 2014-12-02修回）

（本文編輯 胡小寧）

Effects of PPARγ on malignant arrhythmia in myocardial ischemia/reperfusion model rats

HE Xueshu，MO Xinling△，CHEN Hua，XIE Ting
Department of Cardiology，The Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001，China
△Corresponding Author E-mail:glmxl1003@163.com

Objective To investigate the effects of peroxisome proliferator activated receptor gamma（PPARγ）on malignant arrhythmia in myocardial of ischemia/reperfusion（I/R）rats.Methods Twenty-four SD rats were randomly divided into four groups:Sham group，I/R group，rosiglitazone（ROS）group and PPARγ inhibitor GW9662（GW）group.The myocardial I/R injury was induced by ligation of the left anterior descending coronary artery，with ischemia for 30 min and reperfusion for 2 h.The whole process limbⅡlead electrocardiogram was applied to observe the frequency of malignant arrhythmia and record the corrected changes of QT（QTc）interval.RT-PCR was used to detect the expression of PPARγ mRNA.Results There were 5 cases of malignant arrhythmia in ROS group，2 in I/R and 1 in GW group，0 was found in Sham group.There was a prolongation of the QTc interval in ROS group than the other groups after ischemic stage（P＜0.05）.Compared with I/R group and ROS group，the QTc intervals were shorten in ischemia 30 min and reperfusion process in GW group（P＜0.05）.Compared with sham group，the expression of PPARγ mRNA was significantly increased in other three groups（P＜0.05）.The expression level of PPARγ mRNA was the highest in ROS group.The expression level of PPARγ mRNA was reduced in GW group compared with that of I/R group and ROS group（P＜0.05）.Conclusion Over expression of PPARγ may lead to the occurrence of malignant arrhythmia in myocardial ischemia/reperfusion rats.

PPAR gamma；myocardium；reperfusion injury；arrhythmia；rosiglitazone

R541.7

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.011

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌課題（Z2013492）；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳重點(diǎn)科研課題（重2010049）

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科（郵編541001）

何學(xué)?。?985），男，碩士在讀，主要從事高血壓、冠心病的防治研究

△E-mail:glmxl1003@163.com