熊湘明

三伏咳喘膏治療支氣管哮喘的實驗研究

熊湘明

目的 觀察三伏咳喘膏貼敷治療對哮喘豚鼠白細胞介素-18（IL-18）、嗜酸性粒細胞（EOS）及肺組織病理的影響，并探討其作用機制。方法 將60只豚鼠隨機分為對照組、模型組、治療1組（穴位貼藥1 h），治療2組（穴位貼藥3 h），治療3組（穴位貼藥6 h），治療4組（注射地塞米松），每組10只。對照組腹腔注射生理鹽水1 mL，其余組均腹腔注射10%的雞卵清白蛋白1 mL致敏，飼養(yǎng)14 d后，于第15天起將對照組之外的所有豚鼠置于4 L密閉玻璃罐中，用1%的雞卵清白蛋白生理鹽水對豚鼠霧化吸入，30～60 s/次，1次/d，連續(xù)1周。模型建立后第2天，對照組及模型組于肺腧、心腧、膈腧處涂抹生理鹽水，紗布包扎固定；治療1～3組，于同樣穴位貼敷三伏咳喘膏（5 mm×5 mm×1 mm），3組分別貼治1 h、3 h、6 h；治療4組于腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液，相應(yīng)穴位處涂抹生理鹽水固定；各組均是每天貼敷1次，6 h/次，共7 d。結(jié)果 與模型組比較，咳喘膏穴位貼敷各組血IL-18、EOS水平明顯下降，病理學(xué)改變明顯減輕，穴位貼藥3 h組效果最好。結(jié)論 咳喘膏穴位貼敷對哮喘豚鼠血IL-18、EOS有明確影響，可減輕哮喘豚鼠模型氣道炎性損傷。

三伏咳喘膏；穴位貼敷；白細胞介素18；嗜酸性粒細胞；哮喘；豚鼠

支氣管哮喘是由多種細胞和細胞成分參與的氣道慢性炎癥反應(yīng)性疾病，常引起氣道反應(yīng)性增高，具有反復(fù)發(fā)作的特點。穴位貼敷治療支氣管哮喘臨床效果顯著，但其實驗研究開展較少，藥物組成、貼治時間、貼治方案等尚不規(guī)范，缺少系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究［1］。本課題從動物實驗角度研究三伏咳喘膏貼敷對哮喘豚鼠白細胞介素-18（IL-18）、嗜酸性粒細胞（EOS）及肺組織病理的影響，為今后運用此法治療支氣管哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 超聲霧化器（北京亞都空氣凈化技術(shù)有限公司，型號：YC-D203），生物組織顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：BX-41），酶標儀（美國BIO-RAD公司，型號：mod-el-680），血細胞分析儀/細胞計數(shù)器（日本NIHON KOHDEN公司，型號：L180045）。

1.1.2 試劑 三伏咳喘膏由天津市公安醫(yī)院制劑室提供（批號：TJZB-Z2007010278），主要成分；白芥子、甘遂、芫花、細辛、牡荊葉、麻黃、沉香、百合、生姜等。雞卵清白蛋白購自美國Sigma公司；IL-18酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自美國RB公司。

1.1.3 動物 清潔級健康雄性豚鼠60只，平均體質(zhì)量（300± 50）g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動物中心。采用隨機數(shù)字表法隨機分為6組：對照組，模型組，治療1組（穴位貼藥1 h），治療2組（穴位貼藥3 h），治療3組（穴位貼藥6 h），治療4組（注射地塞米松），每組10只。

1.2 方法

1.2.1 建立哮喘模型 均自然喂養(yǎng)，對照組腹腔注射生理鹽水1 mL，其余組均腹腔注射10%的雞卵清白蛋白1 mL致敏，飼養(yǎng)14 d后，于第15天起將對照組之外的所有豚鼠分別置于4 L密閉玻璃罐中，用1%的雞卵清白蛋白生理鹽水對豚鼠霧化吸入，30～60 s/次，1次/d，連續(xù)1周，至豚鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸深快、點頭運動為模型建立成功［2］。

1.2.2 實驗方法 建立模型后第2天，在相當(dāng)于人體督脈和膀胱經(jīng)處備皮。對照組及模型組于肺腧、心腧、膈腧處［3］涂抹生理鹽水，紗布包扎固定；治療1～3組，于同樣穴位貼敷三伏咳喘膏（5 mm×5 mm×1 mm），3組分別貼治1 h、3 h、6 h；治療4組于腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液，相應(yīng)穴位處涂抹生理鹽水固定；各組均是每天貼敷1次，6 h/次，共7 d。治療結(jié)束24 h內(nèi)股動脈放血處死，收集血液，4 000 r/min離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫法測定IL-18（操作按試劑說明進行），血細胞分析儀測定EOS。解剖取肺臟，用4%甲醛溶液浸泡固定，切3 μm薄片，石蠟包埋，HE染色，光鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 測定結(jié)果以x±s表示，運用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組比較采用方差分析，組間多重比較用LSD-t，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-18檢測結(jié)果 治療1組、治療3組、治療4組、模型組的IL-18均高于對照組，治療1～4組的IL-18水平低于模型組（P＜0.05）；4個治療組之間IL-18比較，治療2組IL-18水平最低（P＜0.05），見表1。

2.2 EOS檢測結(jié)果 模型組EOS明顯高于對照組，治療1、2、4組的EOS水平均低于模型組（均P＜0.05）；治療組之間EOS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.3 肺組織病理檢測結(jié)果 對照組肺泡大小均勻一致，未見肺泡擴張；肺泡腔內(nèi)未見炎性細胞浸潤；細支氣管黏膜上皮排列整齊，腔內(nèi)無黏液積聚，見圖1。模型組細支氣管黏膜上皮排列紊亂，增生明顯；黏膜上皮、基底膜增厚；黏膜下層可見多量單核細胞和嗜酸性粒細胞浸潤；細支氣管腔內(nèi)有黏液積聚，見圖2。治療1組黏膜上皮增生、基底膜增厚程度較模型組明顯減輕；黏膜下層可見少量單核細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，細支氣管腔內(nèi)無黏液積聚，見圖3。治療2組細支氣管黏膜上皮排列紊亂，增生明顯；黏膜上皮、基底膜增厚；黏膜下層未見單核細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，細支氣管腔內(nèi)無黏液積聚，見圖4。治療3組黏膜上皮增生、基底膜增厚程度較模型組明顯減輕；黏膜下層可見中量單核細胞和嗜酸性粒細胞浸潤；細支氣管腔內(nèi)少量黏液積聚，病變較模型組輕，見圖5。治療4組黏膜上皮增生、基底膜增厚程度較模型組明顯減輕；黏膜下層可見少量單核細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，細支氣管腔內(nèi)無黏液積聚，見圖6。

Tab.1 Comparison of IL-18 and EOS levels between six group表1 各組IL-18、EOS水平比較 （n=10，x±s）

3 討論

3.1 穴位貼敷治療哮喘 穴位貼敷屬中醫(yī)外治法，秦漢時期就有哮喘外治法的記載，不同歷史時期均有發(fā)展。我院三伏咳喘膏是《張氏醫(yī)通》白芥子涂法的繼承與發(fā)展，中藥選取白芥子、沉香、細辛等，貼敷于肺腧、心腧、膈腧等穴。通過刺激穴位，疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)理氣血陰陽，能有效治療與預(yù)防支氣管哮喘，所取中藥具有發(fā)散、走竄的性質(zhì)，能迅速透過皮膚，發(fā)揮其藥理作用［4-5］。

3.2 三伏咳喘膏對哮喘豚鼠IL-18的影響 IL-18能誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生多種細胞因子，增強Th1細胞活性，在支氣管哮喘發(fā)病及氣道炎癥中起重要作用，與速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)及EOS增多癥等疾病密切相關(guān)［6-7］。IL-18能直接刺激肥大細胞釋放組胺，增加EOS的水平，通過募集EOS和刺激IgE的產(chǎn)生來引發(fā)過敏性炎癥及氣道高反應(yīng)［8］。本研究結(jié)果顯示，模型組IL-18水平明顯升高，證明其在支氣管哮喘發(fā)作氣道炎癥反應(yīng)中起重要作用，在炎癥介質(zhì)中有特殊的誘導(dǎo)方式。穴位貼敷治療各組的IL-18水平均低于模型組，提示三伏咳喘膏穴位貼敷可降低IL-18水平，減輕Th2型免疫應(yīng)答，間接抑制肥大細胞釋放組胺，減輕EOS浸潤，抑制氣道高反應(yīng)，從而減輕氣道的炎癥程度。進一步分析發(fā)現(xiàn)，穴位貼藥3 h組的IL-18水平低于穴位貼藥1 h組和6 h組，且6 h組可見炎性細胞浸潤及明顯的病理損傷，說明貼治效果不隨貼治時間的延長而提高，穴位貼藥3 h效果最好。

3.3 三伏咳喘膏貼敷對哮喘豚鼠EOS的影響 EOS是哮喘氣道炎癥的關(guān)鍵效應(yīng)細胞，在氣道慢性結(jié)構(gòu)改變中起主要作用，與氣道高反應(yīng)、氣道上皮細胞損傷高度相關(guān)［9-10］。哮喘發(fā)作狀態(tài)下，氣道里有大量嗜EOS浸潤，EOS參與哮喘的發(fā)病，在變應(yīng)原刺激后，外周血、支氣管黏膜和支氣管肺泡灌洗液（BALF液）中可檢測到大量EOS，其水平可作為了解支氣管哮喘發(fā)病機制和預(yù)后的一項重要指標［11］。本研究結(jié)果顯示，模型組EOS水平明顯升高，穴位貼藥1 h、3 h組及地塞米松組EOS均低于模型組，提示三伏咳喘膏穴位貼敷能降低哮喘豚鼠EOS水平，減輕氣道炎癥反應(yīng)。

（圖1～6見插頁）

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（2014-10-10收稿 2014-12-30修回）

（本文編輯 閆娟）

Study of sanfukechuangao acupoint application for treatment of asthma in guinea pigs

XIONG Xiangming
Gongan Hospital of Tianjin，Tianjin 300211，China

Objective To observe the effect of sanfukechuangao acupoint application on changes of interleukin-18 （IL-18），eosinophils（EOS）and pulmonary pathology in asthma model of guinea pigs，and its underlying mechanism thereof.Methods A total of 60 guinea pigs were randomized into normal control group，asthma model group，acupoint-application 1 h group，acupoint-application 3 h group，acupoint-application 6 h group and dexamethasone group.Asthma model was established by intraperitoneal injection of 10%ovalbumin（OVA，1 mL）and forced inhalation of atomized 2%OVA.Skin preparation and external application of Chinese medicinal herbs were made on back of guinea pigs，and"Feishu"，"Xinshu"，"Geshu"were selected in acupuncture points）.Levels of IL-18 and EOS were detected by immunohistochemisty method.Results Compared with model group，the levels of IL-18 and EOS were significantly decreased，the pathological changes were significantly reduced in three acupoint-application groups.The effectiveness of acupoint-application 3 h group was the best in three groups.Conclusion Sanfukechuangao acupoint application can influence the levels of IL-18 and EOS effectively，and relieve phlegmonosis injuries in pulmonary tissue of asthma model of guinea pig.

sanfukechuangao；acupoint application；interleukin-18；eosnophils；asthma；guinea pigs

R242

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.008

天津市公安局科研項目（2008023）

天津市公安醫(yī)院（郵編300211）

熊湘明（1971），男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合呼吸系統(tǒng)疾病研究