郭蓉，寧向紅，姜葵，張慶瑜

甲基化調(diào)節(jié)miR-200b的表達及其對胃癌MGC-803細胞增殖侵襲能力的影響

郭蓉，寧向紅，姜葵，張慶瑜△

目的 體外研究基因miR-200b發(fā)生甲基化的不同程度及其表達量的差異對胃癌細胞MGC-803增殖、侵襲、凋亡及對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。方法 以正常胃黏膜上皮細胞GES-1、胃癌細胞MGC-803為研究對象，提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行實時熒光定量PCR檢測2種細胞系中miR-200b的表達量；亞硫酸氫鈉修飾PCR（BSP）法檢測miR-200b啟動子區(qū)甲基化水平。用不同濃度5-氮雜胞苷（5′-Aza-CdR）藥物處理MGC-803細胞72 h后，同法檢測miR-200b的表達量及啟動子區(qū)甲基化水平變化。根據(jù)上述實驗結(jié)果選擇合適的藥物作用濃度和時間即（10 μmol/L，72 h）作為處理組。通過Transwell侵襲實驗觀測細胞侵襲能力；流式細胞技術檢測細胞周期及凋亡的分布情況；Western-blot檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關指標E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9等的表達水平。結(jié)果 miR-200b在GES-1中表達量較MGC-803高（P=0.022）。啟動子區(qū)甲基化水平則與之相反（P=0.034）。藥物不同濃度作用后的MGC-803細胞系miR-200b表達量有隨濃度升高而升高的趨勢，作用濃度為10 μmol/L時miR-200b啟動子區(qū)甲基化水平較對照組低（P=0.043）。與對照組相比，處理組細胞晚期凋亡數(shù)增多；G0/G1期細胞數(shù)顯著增多，S期顯著減少；穿過Transwell小室細胞數(shù)顯著減少；Western-blot實驗表明E-cad?herin表達量升高，N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9表達量降低。結(jié)論 miR-200b啟動子區(qū)甲基化程度的不同可以影響其表達量，而miR-200b表達量的異常又與胃癌MGC-803細胞增殖、侵襲能力密切相關。

胃腫瘤；腺癌；細胞凋亡；細胞增殖；DNA甲基化；微RNA-200b

表觀遺傳學修飾包括DNA甲基化及組織蛋白乙?；?，它們在腫瘤形成和發(fā)展過程中有很重要的作用，尤其是DNA甲基化［1］。DNA甲基化是在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG 2個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基形成5-甲基胞嘧啶后對腫瘤進行調(diào)節(jié)的。研究已證實，基因啟動子區(qū)發(fā)生異常甲基化后可對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生一定的影響，如P21基因啟動子區(qū)高度甲基化后導致表達量降低，同時增加了乳腺癌的發(fā)病率［2］；miR-200b和甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑共同作用可以在不同程度上阻止間質(zhì)表型肝細胞癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移［3］。Micro-RNAs是由19～22個核苷酸組成的非編碼RNA，主要結(jié)合在目標mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR），通過轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)節(jié)［4］。Mi-RNAs的表達模式具有高度保守性、時序性和組織特異性，在不同組織、不同發(fā)育階段中表達水平有顯著差異，是調(diào)控其他功能基因表達的重要分子［5］。本實驗旨在研究miR-200b基因啟動子區(qū)異常甲基化的程度與基因表達量的關系，及基因甲基化作用對胃癌MGC-803細胞增殖、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 GES-1細胞購自北京腫瘤細胞庫，MGC-803細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。甲基化作用抑制劑5-氮雜胞苷（5′-Aza-CdR）購自美國Sigma公司，TRIZOL試劑購自美國Ambion公司，dNTP mixture、反轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）、RNase抑制劑購自大連TaKaRa公司，熒光定量miRNAPCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄引物及RT-PCR引物購自上海吉瑪公司。NI-細胞基因組DNA提取試劑盒，處理、純化回收DNA的EpiTect Bisulfite kit，No.59104試劑盒購自QIA?GEN公司，pMD?18-T Vector Cloning Kit購自大連TaKaRa公司。細胞凋亡檢測采用南京凱基公司Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，Matrigel購自美國BD公司，E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9單克隆抗體均購自美國Cellsignal公司，相應二抗均購自中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組處理 GES-1、MGC-803細胞接種于含10%胎牛血清（56℃水浴滅活40min）DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃含有5%CO2的濕潤空氣恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗時細胞處于對數(shù)生長期。第一部分：驗證miR-200b 在GES-1、MGC-803細胞中的表達量差異。第二部分：用不同濃度5′-Aza-CdR（2.5、5、7.5、10 μmol/L）作用胃癌MGC-803細胞72 h后，檢測miR-200b表達量差異，并選擇miR-200b升高較明顯所對應藥物濃度作為處理組進行下一步實驗，對照組為相同條件下空白對照。第三部分：驗證miR-200b表達量差異在調(diào)節(jié)增殖、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。

1.2.2 RNA提取及實時熒光定量PCR法檢測miR-200b表達量變化 TRIZOL法提取生長狀態(tài)良好的GES-1和處理前后的MGC-803細胞總RNA，依照試劑盒說明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應體系，所用引物為特異miR-200b逆轉(zhuǎn)錄引物以及內(nèi)參U6逆轉(zhuǎn)錄引物，得到cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：95℃5 min，37℃1 h。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進行PCR反應，檢測miR-200b表達量變化。PCR反應條件：預變性95℃ 5min，95℃ 30s，62℃ 30s，共40個循環(huán)，得出各組Ct值，所得結(jié)果按照2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾測序PCR（BSP）法檢測miR-200b基因啟動子區(qū)甲基化水平變化 用NI-細胞基因組DNA提取試劑盒提取GES-1、MGC-803細胞系基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。使用QIAGEN（EpiTect Bisulfite kit，No.59104）試劑盒處理、純化回收DNA并作為模板，設計并驗證合成引物4對進行PCR，從中優(yōu)選1對引物，其特異性引物序列：上游5′-GTATTTAGAGGAAGATGAGATG-3′，下游5′-AACCTAACTTATTAATTAACCTAC-3′，產(chǎn)物372 bp。擴增條件為95℃ 5min，95℃ 40s、54℃ 40s、72℃ 50s，共40個循環(huán)，72℃ 10min，產(chǎn)物回收后使用TaKaRa（pMD?18-T Vector Cloning Kit）連結(jié)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，搖菌后涂板（加Amp的LB固體培養(yǎng)基），做菌落PCR檢測，挑取陽性菌放入加有Amp的LB液體培養(yǎng)基搖菌，過夜后測序。使用BiQAnalyzer軟件對測序結(jié)果進行CpG島甲基化水平分析。

1.2.4 細胞凋亡測定 選擇生長在直徑為60 mm培養(yǎng)皿中MGC-803細胞系處理組和對照組，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用不含EDTA的胰酶消化收集于EP管中，1 000 r/min離心5 min后棄去上清，PBS洗滌2～3次后收集細胞（1～5）×105個/mL，按說明書加入凱基凋亡試劑盒中試劑，室溫避光反應5～15 min，立即于real-tec流式細胞儀中于488 nm激發(fā)波長下檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 細胞周期測定 選擇生長在6孔板中的MGC-803細胞系處理組和對照組，常規(guī)消化離心細胞，收集于EP管中，之后于EP管中加入約500 μL預冷的75%乙醇溶液，于4℃冰箱固定過夜，離心后棄去乙醇，PBS洗滌2次，加入300 μL PI溶液。避光染色20 min后，1 000 r/min離心5 min，棄去染料，PBS洗滌后于流式細胞儀488 nm波長下檢測各組細胞周期分布情況。

1.2.6 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 在8 μm小孔聚碳酸酯濾膜的培養(yǎng)小室上鋪用預冷無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的Matrigel機制膠（Matrigel∶DMEM=1∶2）30 μL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育待其凝固，接種150 μL無血清培養(yǎng)基稀釋MGC-803細胞約50 000個，下室加入500 μL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，每組設3個復孔。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，棄去上室液體，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，蘇木精染色5 min，PBS洗滌。DP-70熒光相差倒置顯微鏡（×100）采集圖像，隨機讀取3個視野，計算穿過膜的細胞數(shù)并取平均值。

1.2.7 Western-blot檢測細胞蛋白表達水平 分別收集對照組及處理組MGC-803細胞，用細胞裂解液RIPA裂解提取細胞總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒壓80 V電轉(zhuǎn)移至PVDF印跡膜。膜封閉液封閉1 h后，加入一抗E-cad?herin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9、GAPDH（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。次日室溫復溫30 min后PBST洗膜，用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000稀釋）室溫孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)采集成像。GAPDH蛋白作為內(nèi)參。以目標蛋白條帶灰度值/同一樣本內(nèi)參條帶灰度值計算目標蛋白相對表達量。以上實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 11.0軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組之間差異比較使用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗；2組間比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GES-1和MGC-803細胞miR-200b的表達水平 GES-1細胞中miR-200b表達高于MGC-803細胞（3.84±0.43 vs 1.98±0.29，t=6.709，P=0.022）。

2.2 不同濃度處理對MGC-803中miR-200b表達水平的影響 不同濃度（0、2.5、5.0、7.5、10 μmol/L）5′-Aza-CdR處理MGC-803細胞72 h后miR-200b表達量分別為1.00±0.00、2.35±0.39、2.28±0.26、3.36±0.01、5.98±0.63，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.283，P＜0.01），以10 μmol/L升高較為顯著。

2.3 GES-1和MGC-803細胞miR-200b啟動子區(qū)甲基化差異 MGC-803中miR-200b啟動子區(qū)發(fā)生甲基化程度較GES-1顯著升高（［93.80±6.00）%vs （78.10±7.60）%，t=5.636，P=0.034］。

2.4 MGC-803處理組和對照組中miR-200b啟動子區(qū)甲基化差異 10 μmol/L 5′-Aza-CdR處理組細胞甲基化程度較對照組降低（［87.50±11.30）%vs （93.80±6.00）%，t=4.642，P=0.043］。GES-1和MGC-803對照組及處理組的miR-200b啟動子區(qū)甲基化位點圖，見圖1。

Fig.1 Methylation profiles around the transcriptional start site of miR-200b in GES-1 and MGC-803圖1 GES-1和MGC-803對照組及處理組的miR-200b啟動子區(qū)甲基化位點圖

2.5 去甲基化處理后MGC-803細胞凋亡水平變化結(jié)果 MGC-803處理組較對照組晚期細胞凋亡率增加（［5.25±0.32）%vs（3.52±0.18）%，t=9.636，P= 0.011］，見圖2。

Fig.2 Ratio of apoptotic cells in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells圖2 處理組和對照組MGC-803細胞系凋亡率

2.6 去甲基化處理后 MGC-803細胞周期變化 MGC-803處理組較對照組q細胞大多被阻滯在G0/G1期，而G2/M期、S期的細胞數(shù)明顯減少（均P＜0.01），見圖3、表1。

Fig.3 Cell cycle profiles of MGC-803 after 5′-Aza-CdR treatment圖3 5′-Aza-CdR處理后的MGC-803細胞周期圖

Tab.1 The percentages of various cell phages in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表1 處理組和對照組MGC-803細胞在不同細胞周期的比例 （n=3，%，±s）

Tab.1 The percentages of various cell phages in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表1 處理組和對照組MGC-803細胞在不同細胞周期的比例 （n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01

組別對照組處理組t G0/G1期56.44±1.64 67.63±1.89 19.580＊＊G2/M期9.32±0.15 12.91±0.21 4.532＊＊S期34.24±0.88 19.46±0.45 7.357＊＊

2.7 去甲基化處理后MGC-803細胞系侵襲能力變化 與對照組相比，處理組穿過小室的細胞數(shù)顯著減少，且每個視野的細胞數(shù)均少于對照組（［11.03± 0.93）個 vs（18.82±1.36）個，t=6.722，P=0.021］，見圖4。

2.8 MGC-803細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關蛋白表達變化 處理組MGC-803細胞中E-cadherin蛋白相對表達水平較對照組明顯升高（P＜0.01），而N-cad?herin、ZEB1、Slug、MMP9較對照組明顯降低（P＜0.01），見圖5、表2。

Fig.4 The invasiveness of MGC-803 after 5′-Aza-CdR treatment圖4 5′-Aza-CdR處理MGC-803細胞后侵襲能力的變化（×100）

Fig.5 The protein expression levels of E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug，MMP9 in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells圖5 MGC-803處理組及對照組中E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9蛋白表達水平

Tab.2 Comparison of protein expression levels of E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug，MMP9 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表2 MGC-803處理組及對照組中E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9蛋白表達水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug，MMP9 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表2 MGC-803處理組及對照組中E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9蛋白表達水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別對照組處理組t E-cadherin 0.22±0.03 1.81±0.04 11.452＊＊N-cadherin 1.93±0.02 0.86±0.01 5.365＊＊ZEB1 1.58±0.01 0.64±0.05 6.941＊＊Slug 1.62±0.06 0.29±0.07 8.758＊＊MMP9 1.58±0.02 0.16±0.03 9.280＊＊

3 討論

3.1 基因異常甲基化的作用 異常DNA甲基化和組織蛋白乙酰化是表觀遺傳學修飾中最主要的兩部分，在基因致癌與抑癌研究中有重要作用［6］。其能在不改變DNA序列的前提下，改變生物的遺傳表象［7］。當基因發(fā)生異常甲基化時，常導致轉(zhuǎn)錄沉默，使重要基因如抑癌基因、DNA修復基因等喪失功能，從而導致正常細胞的生長分化調(diào)控失常以及DNA損傷不能被及時修復，這與多種腫瘤形成密切相關［8］。MiR-200b是長度僅有19～22 nt的核苷酸片段。本次研究證實miR-200b上游啟動子區(qū)有CpG島聚集區(qū)并且這些區(qū)域有甲基化現(xiàn)象存在，啟動子區(qū)發(fā)生甲基化后，影響基因正常轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，導致其表達量降低；同時也可以在不同程度上增強腫瘤細胞MGC-803的侵襲性和增殖性。

3.2 5′-Aza-CdR的去甲基化作用 5′-Aza-CdR 是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的抑制劑，它可以和DNMT發(fā)生共價結(jié)合導致酶活性降低，進而影響甲基化發(fā)生率，并使由于甲基化原因?qū)е鲁聊幕蛑匦卤磉_。本研究證實5′-Aza-CdR可以部分逆轉(zhuǎn)miR-200b啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，從而使由于異常甲基化作用導致的低表達狀態(tài)發(fā)生上調(diào)，進而降低胃癌MGC-803細胞的惡性侵襲與增殖性。

3.3 EMT的發(fā)生受miR-200b表達量的影響 EMT被認為是轉(zhuǎn)移性腫瘤形成的最早的步驟［9］，同時也是組織重新塑造的關鍵因素。EMT的特點是：代表上皮標志的指標（如E-cadherin）消失，而代表間充質(zhì)標志的指標（如N-cadherin、ZEB1、Slug）上調(diào)［10］。研究表明，miR-200a的抑癌作用主要是通過抑制正常EMT，其具體機制是通過作用于其靶點ZEB1/ZEB2，降低對E-cadherin的抑制作用，促進E-cadherin高表達［11］。本研究證實，受不同程度甲基化影響的miR-200b表達量也可以影響EMT相關蛋白的表達。

本研究表明，miR-200b啟動子區(qū)高度甲基化狀態(tài)是導致其低表達的主要原因，而在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的作用下，可使低表達量的miR-200b發(fā)生上調(diào)。對于在胃癌細胞MGC-803中充當抑癌基因的miR-200b來說，其甲基化狀態(tài)的不同會直接影響其表達量，進而間接影響其抑癌作用，導致MGC-803的惡性增殖和侵襲性發(fā)生改變，并影響EMT相關蛋白的表達。因此，基因異常甲基化的相關研究在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預防及治療方面具有重要意義。

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（2014-11-12收稿 2015-01-21修回）

（本文編輯 李鵬）

Methylation of miR-200b and its effects on proliferation，invasion of gastric cancer cell line MGC-803

GUO Rong，NING Xianghong，JIANG Kui，ZHANG Qingyu△
Department of Gastroenterology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China
△Corresponding Author E-mail：zhangqy@tijmu.edu.cn

Objective To investigate the effect of expression level and methylation level of miR-200b on proliferation，invasion and apoptosis of gastric cancer cell line MGC-803 in vitro.Methods Normal human gastric epithelium cell line GES-1，and gastric cancer cell line MGC-803 cells were cultured and harvested to extract total RNA.Then miR-200b ex?pression level was examined via q-PCR；Methylation in promoter of miR-200b was revealed by Bisulphite PCR.MGC-803 cells were treated with different concentrations of 5′-Aza-CdR to test its effect on miR-200b expression and methylation of its promotor.The effect of its treatment at 10 μmol/L for 72 h on invasion，proliferation and apoptosis of both cell lines were detected by Transwell assay，F(xiàn)low cytometry and apoptosis assay respectively.The gene related to EMT（epithelial-mesen?chymal transition）such as E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug were checked by Western blot.Results The expression of miR-200b in GES-1 is higher than that in MGC-803（P=0.022）.The methylation level in promoter region of miR-200b in GES-1 is lower than that in MGC-803（P=0.034）.After treated with 5′-Aza-CdR，the expression of miR-200b in MGC-803 cell was up-regulated in a timely dependent manner.On the contrary，the methylation in promoter of mirR-200b were down-regulated when 5′-Aza-CdR were added at 10 μmol/L（P=0.043）.What's more，5′-Aza-CdR administration increas?es cell apoptosis especially in aged cells and delays cell cycle at G0/G1which in turn decrease ratio of cells in S phages.5′-Aza-CdR treatment also decreased invasiveness and induced expression of E-cadherin，as well as down regulated the ex?pressions of N-cadhrin，ZEB1，Slug and MMP9 in MGC-803 cells.Conclusion Expression of miR-200b could be affected by methylation of promoter of miR-200b and in turn regulate proliferation and invasion of gastric cells in vitro.

stomach neoplasms；adenocarcinoma；cell apoptosis；cell proliferation；DNA methylation；microRNA-200b

R735.2，R349.6

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.002

國家自然科學基金資助項目（81172356）；天津市自然科學基金重點項目（10JCZDJC18500）

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內(nèi)科（郵編300052）

郭蓉（1987），女，碩士在讀，主要從事胃癌發(fā)病機制研究

△E-mail：zhangqy@tijmu.edu.cn