周永紅，胡懷強(qiáng)，張　皓

化濁行血顆粒對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠頸動(dòng)脈炎癥因子的影響*

周永紅1，胡懷強(qiáng)2，張皓1

（1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)教研室，青島266021；2.中國(guó)人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，濟(jì)南250031）

［目的］研究化濁行血顆粒對(duì)食餌性動(dòng)脈粥樣硬化（AS）模型大鼠頸總動(dòng)脈過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）、核因子-κB（NF-κB）的影響，探討中藥治療AS作用機(jī)制。［方法］實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和藥物組，每組12只，采用高脂飼料法建立大鼠食餌性AS模型。藥物組給予化濁行血顆粒水溶液，正常對(duì)照組、模型組分別給予等容量的蒸餾水，連續(xù)8周。實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定PPARmRNA，免疫印跡法觀察NF-κB表達(dá)。［結(jié)果］與正常對(duì)照組比較，模型組頸動(dòng)脈內(nèi)PPARα、PPARβ及PPARγ含量顯著降低（P＜0.01），藥物組PPARα、PPARβ及PPARγ含量顯著升高（P＜0.01），模型組和藥物組NF-κB均顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，藥物組PPARα、PPARβ及PPARγ含量顯著升高（P＜0.01），藥物組NF-κB顯著降低（P＜0.01）。［結(jié)論］化濁行血顆?？杉せ頟PARα、PPARβ及PPARγ，拮抗NF-κB，從而抑制AS的發(fā)生、發(fā)展。

化濁行血顆粒；動(dòng)脈粥樣硬化；過氧化物酶體增殖物激活受體；NF-κB

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.04.08

以動(dòng)脈粥樣硬化（AS）為主要病理基礎(chǔ)的慢性疾病嚴(yán)重威脅人類健康，已經(jīng)成為中國(guó)的重大公共衛(wèi)生問題［1］，防治AS具有重要的健康效應(yīng)和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)［2］。AS是一種復(fù)雜的血管炎性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿其發(fā)生、發(fā)展的全過程［3］。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）可抑制AS形成［4］，核因子-κB（NF-κB）的活化可誘發(fā)AS產(chǎn)生并加重其發(fā)展［5］。筆者觀察了化濁行血顆粒對(duì)食餌性AS大鼠頸總動(dòng)脈PPARs、NF-κB的作用，以期揭示中藥復(fù)方治療AS的可能機(jī)制。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK（魯）20090001（山東省科學(xué)技術(shù)廳發(fā)），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：魯動(dòng)質(zhì)號(hào)1205215（山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)發(fā)），檢疫后備用，自由攝食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物化濁行血顆粒，主要由荷葉、焦山楂、決明子、制水蛭、酒大黃、赤芍、路路通、虎杖、何首烏等組成，由山東魯信藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：2012031701），并按照成人劑量的20倍［12 g/（kg·d）］將其制成水溶液，濃度為1.2 g/mL（即10 mL/kg），置于4℃冰箱中備用。

1.1.3主要試劑Trizol試劑，Invitrogen life technologies；RNA酶抑制劑、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，Epicentre；NF-κB抗體，美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞及組織總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，上?？党缮锕こ逃邢薰荆粷饪s型DAB試劑盒，北京中杉金橋生物科技有限公司；Tris，美國(guó)Sigma公司。

1.2方法

1.2.1分組方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購買后，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，1周后按體質(zhì)量區(qū)組化后隨機(jī)設(shè)計(jì)分為正常對(duì)照組、模型組和藥物組，每組大鼠各12只。因灌胃致吸入性肺炎模型組死亡2只、藥物組死亡1只。

1.2.2造模方法參照文獻(xiàn)［6］建立大鼠食餌性AS模型，AS大鼠（包括藥物組和模型組）喂食高脂飼料（配方：3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料），同時(shí)在喂食開始時(shí)一次性腹腔注射維生素D 6×105U/kg。對(duì)照組按照體質(zhì)量給予同等體積的生理鹽水。連續(xù)喂12周。

1.2.3給藥方法造模后，藥物組灌胃給予化濁行

血顆粒水溶液，劑量為12 g/（kg·d）（相當(dāng)于70 kg成人每日10倍用量），正常對(duì)照組、模型組分別給予等容量的蒸餾水，連續(xù)8周。

水利工程啟閉機(jī)是水利工程上用來開啟和關(guān)閉閘門、攔污柵等水工金屬結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵性永久設(shè)備，是水利工程不可分割的重要組成部分。水利工程啟閉機(jī)在運(yùn)行過程中，由于受到軌道摩擦阻力、泥沙淤積阻力，使其荷載變數(shù)增大，甚至可能超過啟閉機(jī)設(shè)計(jì)額定載荷，造成安全隱患。因此，啟閉機(jī)的安全可靠運(yùn)行直接影響到水利工程安全和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益的正常發(fā)揮，對(duì)工程起著舉足輕重的作用。其質(zhì)量的好壞不僅關(guān)系著產(chǎn)品本身的使用效果和壽命，也關(guān)系著水利工程的安全運(yùn)行，甚至關(guān)乎國(guó)家和人民生命財(cái)產(chǎn)安危。

1.2.4動(dòng)物處理與取材給藥結(jié)束后禁食8 h，100 g/L水合氯醛腹腔注射（300 mg/kg）麻醉動(dòng)物，分離頸總動(dòng)脈血管，用生理鹽水沖洗后置于多聚甲醛后固定液（含0.1%DEPC）、4%戊二醛溶液中固定，參照文獻(xiàn)［7-8］制備頸總動(dòng)脈提取物，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆么郎y(cè)。

1.2.5頸總動(dòng)脈PPAR mRNA檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量PCR法。首先組織勻漿、兩相分離、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀等步驟進(jìn)行RNA抽提及質(zhì)量檢測(cè)。然后進(jìn)行cDNA合成，配制退火混合物及RT反應(yīng)液，加10 μL的RT反應(yīng)液到10 μL退火混合物中，37℃水浴60 min，加熱到95℃維持5 min，得RT終溶液即為cDNA溶液，置冰浴待用。最后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋DNA模板，進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，各樣品目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機(jī)器生成，每個(gè)樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對(duì)含量。實(shí)時(shí)定量PCR使用的引物見表1。

表1　設(shè)計(jì)引物列表Tab.1　The design of primers

1.2.6頸總動(dòng)脈NF-κB檢測(cè)采用免疫印跡法觀察。蛋白質(zhì)抽提，按照BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說明書操作進(jìn)行BCA蛋白定量測(cè)定。SDS-PAGE電泳：制備分離膠、制備積層膠、樣品準(zhǔn)備，加入電泳緩沖液，上樣電泳，使用BioRad電泳裝置，樣品首先在80 V恒定電壓下電泳至染料接近分離膠頂端，然后120 V恒定電壓電泳至溴酚藍(lán)剛出膠底部，凝膠電泳于4℃。蛋白轉(zhuǎn)移，膜的封閉和抗體孵育：膜在5%BSA溶液中室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結(jié)合，封閉過的膜加入一抗體4℃過夜，抗原抗體結(jié)合，加入HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體以結(jié)合一級(jí)抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1 h。TKCTM化學(xué)發(fā)光試劑盒中兩種試劑等比例混合為反應(yīng)液，將膜置于反應(yīng)液中室溫孵育3 min，去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X線膠片曝光，對(duì)膠片進(jìn)行掃描，圖片掃描保存為電腦文件，并用Image J分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有資料數(shù)據(jù)用SAS8.1版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、q檢驗(yàn)；組間比較用單因素方差分析，所用計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。P為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1對(duì)AS模型大鼠頸總動(dòng)脈PPAR mRNA的影響見表2。

表2　對(duì)AS模型大鼠頸總動(dòng)脈PPAR mRNA表達(dá)的影響Tab.2　Effects on the expression of PPAR mRNA in common cariod artery of AS rasts

表2　對(duì)AS模型大鼠頸總動(dòng)脈PPAR mRNA表達(dá)的影響Tab.2　Effects on the expression of PPAR mRNA in common cariod artery of AS rasts

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別　n 　P P A R α m R N A 　P P A R β m R N A 　P P A R γ m R N A正常對(duì)照組　1 2 　6 . 5 3 ± 1 . 3 4 　2 . 3 2 ± 0 . 3 6 　2 . 8 6 ± 0 . 5 3模型組　1 0 　4 . 2 3 ± 0 . 6 7* 　1 . 6 2 ± 0 . 2 8* 　1 . 9 4 ± 0 . 5 6*藥物組　1 1 　9 . 0 1 ± 1 . 1 5 *#　2 . 9 7 ± 0 . 3 3 *#　5 . 3 8 ± 1 . 2 2 *#

2.2對(duì)AS模型大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB的影響見表3。

表3　各組大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB表達(dá)的變化（x±s）Tab.3　Variation on the expression of NF-κB in common carotid artery of rats in each group（x±s）

3　討論

AS是一種復(fù)雜的血管炎性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿其發(fā)生、發(fā)展的全過程［3］。PPARs是配體活化的核轉(zhuǎn)錄因子，分為PPARα、PPARδ（或β）和PPARγ 3種亞型，與AS都有著密切的聯(lián)系，可通過抑制炎癥因子，保護(hù)內(nèi)皮功能，抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，以及穩(wěn)定斑塊等方面發(fā)揮著干預(yù)AS進(jìn)程及發(fā)展的作用［13-15］。研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的頸動(dòng)脈PPARα、PPARβ及PPARγ含量較正常對(duì)照組顯著降低，表明PPARs具有抑制AS形成的作用。藥物組PPARα、PPARβ及PPARγ含量較正常對(duì)照組顯著增高，說明化濁行血顆粒具有激活PPARs的作用，藥物組PPARα、PPARβ及PPARγ含量較模型組顯著增高，說明化濁行血顆粒對(duì)PPARs的激活作用優(yōu)于模型組，清化血濁法可上調(diào)PPARs表達(dá)?？梢?，化濁行血顆?？捎行Ъせ頟PARs，從而抑制AS形成、發(fā)生發(fā)展，保護(hù)血管內(nèi)皮。

NF-κB屬于Rel蛋白家族，在機(jī)體多種生物學(xué)活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中均起著重要作用。AS炎癥病變過程中炎性細(xì)胞的激活和炎性細(xì)胞因子的釋放與NF-κB的激活密切相關(guān)［16-17］。激活的NF-κB進(jìn)入胞核與相應(yīng)靶序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和自由基損傷等病理生理過程［18］，在形成AS的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，NF-κB的活化是導(dǎo)致AS一個(gè)中心環(huán)節(jié)［5］，因而對(duì)NF-κB進(jìn)行干預(yù)，可有效控制AS的發(fā)生和發(fā)展。研究結(jié)果顯示，模型組中大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB較正常對(duì)照組明顯升高，兩者之間有顯著性差異，表明高脂飼料喂養(yǎng)可激發(fā)大鼠動(dòng)脈內(nèi)NF-κB活化，從而誘發(fā)、加重AS的發(fā)生、發(fā)展。藥物組大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB較正常對(duì)照組升高，但較模型組明顯降低，且3組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明化濁行血顆?？捎行б种剖仇D性AS模型大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB表達(dá)。動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管病變的基礎(chǔ)，研究表明化濁行血顆?？梢哉{(diào)控AS的形成與發(fā)展。

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（本文編輯：馬英，于春泉）

Effect of Huazhuo Xingxue grains on inflammatory factor in the common carotid artery of atherosclerosis rats

ZHOU Yong-hong1，HU Huai-qiang2，ZHANG Hao1
（1.Department of Traditional Chinese Medicine，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266021，China；2.Department of Neurology，The General Hospital of Jinan Military Command，Jinan 250031，China）

［Objective］To explore the effect of Huazhuo Xingxue grains on peroxisome proliferator-activated receptor（PPAR）and nuclear factor kappa B（NF-κB）in the common carotid artery of atherosclerosis rats.［Methods］The rats were randomly divided into control，model，and medicine groups.The medicine group was administrated with Huazhuo Xingxue grains for a course of 8 weeks after the atherosclerosis model rats were established by high fat diet，the control group and model group were taken oral equivolumetric distilled water.PPAR mRNA was measured by real time PCR，NF-κB was measured by western blotting.［Results］The PPARα，PPARβ and PPARγ of model group obviously decreased，NF-κB of model，medicine groups obviously increased，which were significantly difference with the control group（P＜0.01）.The PPARα，PPARβ and PPARγ of medicine group obviously increased，which were significantly difference with the model group（P＜0.01）.NF-κB of medicine group was significantly less than those of model group（P＜0.01）. ［Conclusion］Huazhuo Xingxue grains can active PPARα，PPARβ and PPARγ and resist NF-κB to inhibit the development of atherosclerosis.

Huazhuo Xingxue grain；atherosclerosis；peroxisome proliferator-activated receptor；nuclear factor kappa B

R541.4

A

1672-1519（2015）04-0220-04

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2010HM109）；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家基金項(xiàng)目（2009BSB02208）。

周永紅（1966-），女，博士，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

胡懷強(qiáng)，E-mail：huhuaiqiang@126.com。

（2014-09-28）