王占奎，劉　坤，肖震心，楊寶旺，林翠茹，周　震，王東平，高　鶴，郭家奎

·實驗研究·

針刺調控大鼠腦缺血再灌注損傷Cx43半通道的機制研究*

王占奎，劉坤，肖震心，楊寶旺，林翠茹，周震，王東平，高鶴，郭家奎

（天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院針灸部，天津300150）

［目的］基于連接蛋白43（Cx43）半通道探討蛋白激酶基因表達在大鼠腦缺血再灌注過程中的動態(tài)變化規(guī)律以及針刺干預的影響。［方法］根據(jù)隨機數(shù)字表將Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、非穴位針刺組及針刺組。采用改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型，模型組及兩個針刺組內分設4個亞組：缺血再灌注30 min組、缺血再灌注60 min組、缺血再灌注180 min組、缺血再灌注360 min組，每組10只大鼠。穴位組電針刺激大鼠的“頂中線”、“頂旁線”；非穴位組取患側肋下髂嵴上10 mm的固定點作為針刺點；模型組不予任何處理。采用熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）技術從基因方面檢測海馬區(qū)蛋白激酶C（PKC）、酪蛋白激酶1（CK1）、蛋白磷酸酶（PP2B）的表達。［結果］與正常組相比，模型組PKC mRNA、CK1 mRNA及PP2B mRNA時間的推移表達量呈增高趨勢；與模型組同一時間點比較，非穴位針刺組PKCmRNA表達無顯著變化（P＞0.05）；調神通絡針刺組可顯著降低其在各時間點表達，與模型組及非穴位針刺組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。［結論］調神通絡針刺組可抑制大鼠腦缺血再灌注過程中PKC mRNA、CK1 mRNA及PP2B mRNA表達，通過調節(jié)Cx43磷酸化或去磷酸化途徑中的關鍵因子，來調控半通道的開放，在缺血性腦損傷中發(fā)揮神經保護作用。

針刺；缺血再灌注；蛋白激酶C；酪蛋白激酶1；蛋白磷酸酶

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.04.07

當缺血性腦卒中發(fā)生時，神經細胞膜連接蛋白43（Cx43）半通道開放，打開了鈣離子等重要物質異常流動的大門，導致神經細胞死亡。已知蛋白激酶C （PKC）、酪蛋白激酶1（CK1）及蛋白磷酸酶（PP2B）對于Cx43磷酸化以及縫隙連接的組裝調控非常重要，能夠通過磷酸化反應調控半通道的開關?！罢{神通絡”針法是本科治療腦梗死的大法，療效確切。該針法治療腦梗死主要機制是通過改善全身狀況，調節(jié)大腦血液循環(huán)，增加腦血流量，加快側支循環(huán)的建立，從而促進腦神經細胞的修復［1-2］。本研究旨在通過檢測腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)Cx43與PKC、CK1、PP2B mRNA表達情況，了解Cx43與PKC、CK1、PP2B在腦缺血再灌注不同時間點的動態(tài)變化規(guī)律，來探討針刺對調控Cx43的分子靶點及信號作用途徑，為針刺治療腦血管病提供重要實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物選用體質量250～300 g健康Wistar大鼠（Ⅱ級）170只，8月齡，雄性，清潔級，均由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供（許可證號SCXK-（軍）2002-001）。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境的室溫為20～22℃，相對濕度為50%左右。

1.2實驗動物分組根據(jù)SPSS 18.0生成的隨機數(shù)字，將大鼠隨機分為正常組、模型組、非穴位針刺組及針刺組。模型組及兩個針刺組內分設4個亞組：缺血再灌注30 min組（I/R-30 min）、缺血再灌注60 min組（I/R-60 min）、缺血再灌注180 min組（I/R-180min）、缺血再灌注360min組（I/R-360min）。每組10只大鼠。

1.3主要實驗儀器與設備Taq DNA聚合酶、三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）、T4 DNA連接酶、EcoR I、pGEM（R）-T Easy Vector（美國Promega公司）；RNA酶抑制劑、SYBR?Green Mix（美國Invitrogen公司）；DNA Marker C（北京賽百盛公司）；DNA純化回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；引物合成和測序在上海博亞生物公司完成；無水乙醇、丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺等（均為國產分析純）等；Contifuge 17RS臺式冷凍離心機（德國Heraeus公司）；實時熒光定量PCR儀（LightCycler，瑞士Roche公司）；SFC-12體視顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；HPIAS-1000彩色圖像分析系統(tǒng)（同濟醫(yī)科大學千屏影像工程公司）；CX40RF200型光鏡（OLYMPUS）等。

2　實驗方法

2.1大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型制備參照Longa［3］線栓法并加以改進。于缺血1 h后拔出栓線，建立缺血再灌注模型，正常組不進行手術處理。實驗過程中對動物的處置均遵守科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》（國科發(fā)財字［2006］398號）有關善待實驗動物的規(guī)定。

2.2模型制備成功標準各手術組均于術后1 h觀察動物行為障礙的程度并進行評分，參考Zausinge等［4］6級5分法來評價模型成功與否：去除評分為0分和5分的動物。0分：不能自發(fā)行走；1分：自由走動狀態(tài)下向病變對側旋轉；2分：抓住鼠尾，大鼠向病變對側旋轉；3分：對于施向病變對側的側壓力抵抗力下降者；4分：不能伸直病變對側前爪；5分：無神經功能缺損。

2.3穴位選擇及針刺方法頭針為“調神通絡”針法的主穴，故選取頂中線（MS5，百會向至前頂）、頂旁線（相當于國標頂旁2線MS9，承靈與正營連線）作為針刺穴位［5］。在模型造模成功后，用自制布袋將大鼠固定于實驗臺上，用直徑25 mm毫針沿皮刺入大鼠的“頂中線”、“頂旁線”。連接電針治療儀（KWD-8081，長城牌）刺激10 min，頻率為2/15 Hz的疏密波，電流強度1 mA，強度以肢體輕微抖動為宜，持續(xù)10 min。非穴位針刺組選取患側肋下髂嵴上10 mm的固定點作為針刺點［6］。正常組和模型組同樣抓取，不作其他處理。

2.4組織取樣及處理各組在規(guī)定時間點斷頭處死，冰上剝離缺血側海馬，迅速放入液氮中冷凍，稍后置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5海馬區(qū)PKC、CK1、PP2B mRNA表達的檢測

2.5.1提取總RNA按照 Trizol試劑盒提取總RNA，加DEPC水20 μL溶解。紫外分光光度計測吸光度（A）值。A260/A280應大于1.8，在0.1 g瓊脂糖凝膠電泳顯示證實含有18 s和28 s兩條帶的標本用于反轉錄。

2.5.2反轉錄校正每組總RNA濃度為1 μg/μL，每 2 μg RNA加入 Oligod（T）181 μL，Waternuclease-free 9 μL，短暫離心后，65℃變性10 min，取出立即置于冰上2 min，后加入5*Reaction Buffer 4 μL，10 mMdNTP 2 μL，RNase-inhibitor 1 μL，MMLV 1 μL，短暫離心后，42℃水浴1 h，70℃水浴5 min，冰上放置2 min，然后于-20℃保存。

PKC上游引物5′AAATCCGAGTCCCACATC3′；下游引物5′CGGGATG CGCTTC AG TTTCACATA3′管家基因：β-actin上游引物：5′GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3′；下游引物5′GACTCATCG ACTCCTGCTTGCTG3′。熒光定量PCR：采用25 μL反應體系：MasterMix 12.5 μL，5 μM ForwardPrimer 0.25 μL，5μMReversePrimer0.25μL，Template2.5μL，Deionized Water 9.5 μL混勻放入熒光定量PCR儀中，95℃，10 min預變性，執(zhí)行95℃，15 s，60℃，1 min，40 cycles，觀察熒光定量溶解度。放入熒光定量PCR儀中，95℃，10 min預變性，執(zhí)行95℃，15 s，58℃，1 min，40 cycles，觀察熒光定量溶解度。

CK1上游引物5′CGTGGGCTACGCTTTGAG3′；下游引物5′TGTGTAGTCATATTGATGGTTCAGG3′；CK1管家基因：β-2微球蛋白B2M基因為內對照：上游引物5′CCT GCTC GGG CT ACTCTC3′下游引物5′CATTCTCTGCTGGGTGACG3′，熒光定量PCR：采用 25 μL反應體系：MasterMix 12.5 μL，5 μM Forward Primer 0.5 μL，5 μM Reverse Primer 0.5 μL，Template 2.0 μL，Deionized Water 9.5 μL混勻放入熒光定量PCR儀中，95℃，10 min預變性，執(zhí)行95℃，15 s，60℃，1 min，40 cycles，觀察熒光定量溶解度。

PP2B上游引物5′GCGGATCCTCACCATACGTACCACCAGT3′下游引物：5′ACC TCGAGTTAAAGGGGCTTACCACCGGGC3′，熒光定量PCR：采用25 μL反應體系：Master Mix 12.5 μL，5 μM ForwardPrimer 0.75 μL，5 μM ReversePrimer 0.75 μL，Template 3 μL，Deionized Water 8 μL混勻放入熒光定量PCR儀中，95℃，10 min預變性，執(zhí)行95℃，15 s，57℃，1 min，40 cycles，觀察熒光定量溶解度。

2.6統(tǒng)計學分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，線間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3　結果

正常組Cx43、PKC、CK1、PP2B mRNA呈基礎水平表達；模型組表達最強，并隨著30、60、180、360min時間的推移，表達量呈增高趨勢；其次為非穴位針刺組，與模型組同一時間點比較，Cx43、PKC、CK1、PP2B mRNA表達無顯著變化（P＞0.05）；調神通絡針刺組對腦缺血再灌注大鼠各時間點Cx43、PKC、CK1、PP2B mRNA表達都有顯著降低作用，與模型組及非穴位針刺組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示針刺對Cx43、PKC、CK1、PP2B mRNA的表達有顯著的抑制作用。見表1-4。

表1　各組大鼠腦缺血再灌注后海馬Cx43含量的影響（x±s）Tab.1　Effects of Cx43 contents in hippocampus of each group of rats after cerebral ischemia reperfusion（x±s）

表2　各組對腦缺血再灌注后海馬PKC mRNA表達的影響（x±s）Tab.2　Effects of the expression of PKC mRNA in hippocampus of each group after cerebral ischemia reperfusion（x±s）

表3　各組對腦缺血再灌注后海馬CK1 mRNA表達的影響（Tab.3　Effects of the expression of CK1 mRNA in hippocampus of each group after cerebral ischemia reperfusion

表3　各組對腦缺血再灌注后海馬CK1 mRNA表達的影響（Tab.3　Effects of the expression of CK1 mRNA in hippocampus of each group after cerebral ischemia reperfusion

注：與正常組相比，*P＜0.05；與同時段模型組相比，#P＜0.05；與同時段非穴針刺組相比，△P＜0.05。

組別　n 　I / R -3 0 m i n 　I / R -6 0 m i n 　I / R -1 8 0 m i n 　I / R -3 6 0 m i n正常組　1 0 　8 . 4 7 ± 0 . 7 4 　8 . 9 9 ± 0 . 9 6 　9 . 0 1 ± 0 . 7 7 　9 . 1 2 ± 0 . 3 4模型組　1 0 1 6 . 8 8 ± 1 . 2 3* 　1 9 . 3 2 ± 1 . 4 7* 　2 4 . 5 7 ± 0 . 8 2* 　3 2 . 9 9 ± 0 . 6 5*非穴針刺組　1 0 1 6 . 5 5 ± 0 . 7 1* 　1 9 . 0 3 ± 0 . 8 3* 　2 5 . 0 4 ± 1 . 1 2* 　3 2 . 1 0 ± 0 . 8 3*針刺組　1 0 1 2 . 3 5 ± 0 . 6 5 *#△1 2 . 6 9 ± 0 . 7 6 *#△1 4 . 8 7 ± 0 . 8 2 *#△2 2 . 8 7 ± 0 . 7 8 *#△

4　討論

半通道的基本結構單位為連接蛋白，Cx43作為主要的連接蛋白在哺乳動物腦組織中表達最強［7］。在特殊條件下（缺血、缺氧、機械刺激［8-9］等因素），半通道可以被激活開放，導致各種物質通過該通道進出細胞，引起神經細胞的損傷。Cx43的磷酸化與去磷酸化對半通道的功能有著非常重要的影響［10］，腦缺血及缺血/再灌注后，星形膠質細胞開放的Cx43介導了細胞間壞死物質的交流和死亡信息的通訊，加重了腦梗死的損傷。磷酸化參與了Cx43生命周期中的各個過程，如轉運、組裝/解離、降解以及半通道的門控，從而影響到縫隙連接細胞間通訊。磷酸化過程受許多激酶的調控，蛋白激酶如PKC、CK1、PP2B，對于磷酸化以及縫隙連接的組裝調控非常重要，通過調控Cx43半通道的變化來影響腦損傷的進展。本實驗結果顯示，模型組各時間點海馬CA1區(qū)的Cx43表達均較正常組明顯增強，腦損傷后30 min Cx43表達已開始增加，隨著時間變化逐漸增強至360 min最為明顯。Cotrina等［11］在研究中發(fā)現(xiàn)，當星形膠質細胞Cx43表達增多，間隙連接功能就增強導致細胞凋亡增加，從而加重腦損害，而在使用間隙連接阻滯劑后，Cx43表達減少，缺氧缺血后腦損害明顯減輕。

表4　各組對腦缺血再灌注后海馬PP2B mRNA表達的影響（Tab.4 Effects of the expression of PP2B mRNA in hippocampus of each group after cerebral ischemia reperfusion

表4　各組對腦缺血再灌注后海馬PP2B mRNA表達的影響（Tab.4 Effects of the expression of PP2B mRNA in hippocampus of each group after cerebral ischemia reperfusion

注：與正常組相比，*P＜0.05；與同時段模型組相比，#P＜0.05；與同時段非穴針刺組相比，△P＜0.05。

組別　n 　I / R -3 0 m i n 　I / R -6 0 m i n 　I / R -1 8 0 m i n 　I / R -3 6 0 m i n正常組　1 0 　6 . 4 3 ± 0 . 7 6 　7 . 9 8 ± 0 . 9 6 　7 . 8 8 ± 0 . 9 2 　7 . 0 3 ± 0 . 4 3模型組　1 0 1 4 . 2 9 ± 1 . 0 3* 　1 7 . 5 7 ± 1 . 4 2* 　2 6 . 5 1 ± 0 . 7 3* 　3 4 . 9 6 ± 0 . 9 2*非穴針刺組　1 0 1 4 . 8 7 ± 0 . 8 8* 　1 7 . 9 3 ± 0 . 6 7* 　2 7 . 4 2 ± 1 . 4 1* 　3 4 . 7 7 ± 0 . 7 1*針刺組　1 0 8 . 7 7 ± 0 . 6 5 *#△　1 0 . 4 2 ± 0 . 5 0 *#△1 5 . 5 5 ± 0 . 8 2 *#△2 3 . 5 8 ± 0 . 6 7 *#△

中風的病因病機和臨床各期癥狀集中地體現(xiàn)在“神”與“絡”這兩大方面，治療中風病要活血通絡，但重在調神。調神通絡針法其治療獨到之處在于根據(jù)臨床辨證的基礎上注重“調神機、通經絡”的運用?！罢{神”則能神機運轉，使臟腑經絡等形體功能有所主宰；“通絡”是在調神的基礎上，疏通腦絡及肢體經絡系統(tǒng)，使經脈氣血運行通暢，促進疾病的好轉。所選主穴頂中線具有調理神明、平肝潛陽、疏通下肢經脈的作用，頂旁線具有調理神明、疏通上肢經脈的作用［12］。前期研究中發(fā)現(xiàn)，調神通絡針法能明顯抑制腦缺血再灌注大鼠PKCγ、PKCδ陽性蛋白表達，進而抑制對N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體通道的磷酸化，減少興奮毒性氨基酸的釋放，使神經元凋亡或壞死細胞數(shù)目減少，避免缺血性腦損害的加重，從而表現(xiàn)出明確的腦保護作用［13］。本研究結果顯示，正常組、假手術組PKC mRNA呈基礎水平表達；模型組表達最強，并隨著30、60、180、360 min時間的推移，表達量呈增高趨勢；其次為非穴位針刺組，與模型組同一時間點比較，PKC mRNA表達無顯著變化（P＞0.05）；針刺組對腦缺血再灌注大鼠各時間點PKC mRNA表達都有顯著降低作用，與模型組及非穴位針刺組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示針刺對PKC mRNA的表達有顯著的抑制作用。針刺可以起到PKC的激活劑的作用，在神經細胞中通過增加Cx43磷酸化來降低Cx43通道的通透性，抑制梗死面積的擴大，從而在腦損傷修復中發(fā)揮重要作用。

CK1作為一種重要的蛋白激酶，在體內及體外通過對底物直接進行磷酸化而行使調節(jié)功能。也可作為其它蛋白激酶的底物被磷酸化，參與蛋白質的級聯(lián)磷酸化過程，通過特異的受體介導而對功能進行調節(jié)，在信號轉導途徑中發(fā)揮作用［14-15］。CK1抑制劑可以增加Cx43在胞膜上的定位，減少縫隙連接的形成，表明這條途徑對于縫隙連接的組裝很重要。本研究結果顯示，大鼠腦缺血再灌注損傷后，正常組、假手術組CK1 mRNA呈基礎水平表達；模型組表達最強，并隨著30、60、180、360 min時間的推移，表達量呈增高趨勢；調神通絡針刺組對腦缺血再灌注大鼠各時間點CK1 mRNA表達都有顯著降低作用，與模型組及非穴位針刺組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示針刺通過對CK1 mRNA的表達的抑制作用，增加Cx43在胞膜上的定位，減少了Cx43的磷酸化及縫隙連接的形成，從而減輕腦損傷。

PP2B又稱鈣調神經磷酸酶（CaN），是腦中一種主要的鈣調素（CaM）結合蛋白，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca2+/鈣調素調節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶［16］。PP2B在細胞信號傳遞過程中接受Ca2+的調節(jié)，起到去磷酸化作用，參與細胞通訊功能調節(jié)［17］。本研究顯示，大鼠腦缺血再灌注損傷后PP2B含量明顯增高，并隨著時間的推移，表達量呈動態(tài)增加趨勢；針刺對腦缺血再灌注大鼠各時間點PP2B mRNA的表達都有顯著降低作用，與模型組及非穴位針刺組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示針刺可有效地調控PP2B對腦缺血后出現(xiàn)的神經細胞內磷酸化和去磷酸化過程的嚴重失衡的影響，阻斷神經元凋亡，具有可靠的缺血性腦保護作用。

綜上，本研究表明，大鼠腦缺血再灌注損傷后，模型組Cx43、PKC、CK1、PP2BmRNA表達增強，并隨著時間的推移，表達量呈增高趨勢。針刺對各時間點Cx43、PKC、CK1、PP2B mRNA表達都有顯著降低作用，提示缺血再灌注損傷導致了Cx43半通道的開放，針刺對腦缺血再灌注損傷后蛋白激酶的基因表達有顯著的抑制作用，這可能和穴位功能可從健康狀態(tài)下的相對“沉寂”變化為疾病狀態(tài)下的相對“激活”有關［18］。針刺所具有的這種雙向調整作用對腦缺血Cx43半通道的打開向更有益腦保護方向發(fā)展起著關鍵作用，其機制可能通過調節(jié)Cx43磷酸化或去磷酸化途徑中的關鍵因子，從而調控缺血性腦損傷時半通道的開放，抑制梗死面積的擴大，由此產生腦保護作用。

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（本文編輯：馬英，于春泉）

Mechanisms of Cx43 semi-channel in cerebral ischemia-reperfusion injury rats by acupuncture regulation

WANG Zhan-kui，LIU Kun，XIAO Zhen-xin，YANG Bao-wang，LIN Cui-ru，ZHOU Zhen，WANG Dong-ping，GAO He，GUO Jia-kui
（The Acupuncture and Encephalopathy Center，The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China）

［Objective］To investigate the dynamic changes of protein kinase gene expression in cerebral ischemia and reperfusion rats and the effect of acupuncture intervention based on Cx43 semi-channel.［Methods］According to the random number table Wistar rats were randomly divided into normal group，model group，the non-acupuncture group and the acupuncture group.Using a modified intraluminal left middle cerebral artery in rat focal cerebral ischemia-reperfusion model，the model group and the two acupuncture groups divided into four subgroups：30 min ischemia-reperfusion group，ischemia-reperfusion 60 min group，ischemia-reperfusion group 180 min and 360 min ischemia-reperfusion groups.Electrical stimulation of acupuncture group were“top middle”and“top next line”；nonacupoint group were ipsilateral iliac crest on the ribs 10 mm fixed point as acupuncture points；model group did not receive any treatment.Quantitative PCR technology was applied to measure the expression of PKC，CK1and PP2B in the hippocampus.［Results］Compared with the normal group and sham operation group，the expression of PKC mRNA，CK1 mRNA and PP2B mRNA in model group showing a rising trend；compared with the model group at the same time point，and there was no significant change of PKC mRNA expression in the non-acupuncture group（P＞0.05）.Tiaoshen Tongluo acupuncture can significantly reduce its expression at each time point，compared with the model group and the non-acupuncture group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.［Conclusion］The Tiaoshen Tongluo acupuncture method may inhibit the expression of PKC mRNA，CK1 mRNA and PP2B mRNA in cerebral ischemia reperfusion rat.Through regulating of key factor phosphorylation of Cx43 phosphate，to control the opening of the semi-channel，playing a neuroprotective role in ischemic brain injury.

acupuncture；ischemia reperfusion；PKC；CK1；PP2B

R743.31

A

1672-1519（2015）04-0215-05

國家自然科學基金資助項目（81102640）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃重點項目（14JCZDJC36800）。

王占奎（1977-），男，博士，主治醫(yī)師，主要從事針灸治療腦血管病的基礎及臨床研究。

郭家奎，E-mail：guojiakui@eyou.com。

（2014-11-16）