朱潔，馬茜，王辛，劉翠梅，王愛紅

肌肽對局灶性腦缺血大鼠bcl-2、bax表達的影響

朱潔，馬茜，王辛，劉翠梅，王愛紅△

目的研究肌肽對局灶性腦缺血大鼠缺血皮質區(qū)B淋巴細胞瘤/白血病-2（bcl-2）、bcl-2相關蛋白X （bax）表達的影響。方法30只SPF級雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和肌肽組，每組10只。模型組和肌肽組以線栓法制作大鼠永久性腦缺血模型，肌肽組于造模后予肌肽水溶液灌胃［1 000 mg/（kg·d）］，其余2組予等量生理鹽水灌胃。分別于造模后清醒時、24 h、72 h通過神經功能缺損評分觀察神經功能，于72 h采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色觀察腦梗死體積、HE染色觀察病理形態(tài)學改變，并用免疫組化法檢測bcl-2和bax表達。結果肌肽組神經功能評分72 h較模型組降低（P＜0.05）；腦組織缺血損傷病理學改變輕于模型組；腦梗死體積72 h較模型組減小（P＜0.01）；腦缺血后72 h與假手術組相比，模型組bcl-2表達下降、bax表達上升、bcl-2/bax比值下降（均P＜0.05）；經肌肽處理后bcl-2表達上升、bax表達下降，bcl-2/bax比值上升（P＜0.01或P＜0.05）。結論肌肽處理能提高bcl-2表達、降低bax表達及提高bcl-2/bax比值，這可能是肌肽發(fā)揮神經保護作用的分子機制之一。

肌肽；腦缺血；基因，bcl-2；bcl-2相關X蛋白質；bcl-2/bax

缺血性腦卒中占全腦卒中的85%左右［1］，其中大多由大腦中動脈阻塞引起。腦缺血引起神經細胞凋亡，細胞凋亡在遲發(fā)型神經元死亡中起重要作用。B淋巴細胞瘤/白血病-2（bcl-2）和bcl-2相關蛋白X（bax）在細胞凋亡中起重要調控作用，bcl-2具有抗細胞凋亡作用，而bax作用相反［2］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)bcl-2和bax調節(jié)細胞凋亡不僅取決于自身的表達水平，還與bcl-2/bax比值有關［3］。研究表明，肌肽對缺血性腦損傷具有保護作用，且具有劑量依賴性，以1 000 mg/kg劑量效果最佳［4-5］。但研究大多集中于腦缺血后24 h，且大多未觀察肌肽對bcl-2/bax比值的影響。本研究通過制作局灶性腦缺血大鼠模型，觀察肌肽對腦缺血大鼠損傷腦組織bcl-2、bax蛋白表達和bcl-2/bax比值的影響，探討肌肽的腦保護作用的可能機制，為其治療缺血性腦血管疾病提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組健康雄性SD大鼠30只，SPF級，體質量280～320 g，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供［合格證編號：SCXK（浙）2008-0033］。隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組和肌肽組，每組10只。

1.2實驗材料和儀器大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）線栓（北京沙東生物技術有限公司）；肌肽、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，美國sigma公司）；bcl-2、bax抗體（巴傲得生物技術有限公司）；ElivisionTMsuper免疫組化試劑盒（福建邁新生物技術有限公司）；Histostar包埋機、Finesse E+手動切片機（美國Thermo公司）；BX41顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；全自動染色機（英國Shandon公司）；ASP300S全自動真空組織脫水機（德國Leica公司）。

1.3實驗方法

1.3.1大鼠局灶性腦缺血模型建立本實驗采用線栓法制作大鼠MCAO模型［6］。腹腔注射10%水合氯醛溶液（3.5 mL/ kg）麻醉。大鼠術后單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進食。假手術組只分離血管，不插入線栓，其余步驟與模型組相同。

1.3.2治療方法肌肽組予肌肽水溶液灌胃，劑量為1 000 mg/（kg·d），溶劑為生理鹽水［4-5］，每天1次；假手術組和模型組予等量生理鹽水灌胃，每天1次；灌胃劑量按照100 g大鼠每天灌胃1 mL計算；首次灌胃時間為造模清醒后2 h以內［7］。

1.3.3神經功能缺損評分參照Bederson［8］5級4分法評定大鼠神經功能缺損。0分：無神經功能缺損。1分：輕微缺損，提尾倒懸時不能完全伸展左側前肢。2分：中度缺損，行走時向左側轉圈。3分：重度缺損，向左側傾倒。4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。評分為0分和4分的大鼠為造模不成功，均被剔除；符合評分但有蛛網膜下腔出血、術中術后死亡亦予以剔除，用同一批次的大鼠造模成功后隨機補充，補足數(shù)目保證分組且每組大鼠數(shù)量不變。

1.3.4TTC染色術后72 h處死大鼠，在冰上迅速取腦，將腦組織放入-20℃冰箱快速冷凍20 min，待組織凍硬后進行冠狀切片（片厚2 mm）。將切片放入1%TTC溶液中，37℃避光染色30 min，每隔10 min翻1次，以保證染色均勻。用4%多聚甲醛固定24 h后拍照，計算梗死體積，正常腦組織染色后呈鮮紅色，梗死區(qū)呈蒼白色。計算公式為：用分辨率（固定為118.11像素/cm）的平方除以總像素，得到以/cm2為單位的面積，得出實際面積（A1～A5），切片厚度（t）固定2 mm，代入公式V=t×［0.5×（A1+A5）+A2+A3+A4］。

1.3.5腦組織病理學檢查術后72 h各組隨機取4只大鼠，麻醉后仰臥位固定，用預冷的4%多聚甲醛溶液心臟灌注，然后迅速斷頭取腦，分離大腦皮質，切取小塊置于4%多聚甲醛中固定24 h，再脫水透明，石蠟包埋切片，HE染色，光化學顯微鏡下觀察大腦皮質形態(tài)結構。

1.3.6bcl-2、bax免疫組化染色術后72 h斷頭取腦，進行免疫組化染色，參照ElivisionTMsuper免疫組化試劑盒說明檢測bcl-2和bax的表達情況。bcl-2和bax表達以胞漿著色呈棕黃色的細胞為陽性細胞。將每張切片于鏡下同一強度隨機讀取右側皮質5個不重疊的400倍視野進行攝片，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測量陽性區(qū)域的累積光密度（integrated optical density，IOD）來反映照片中相應蛋白表達的總量。染色陽性程度越高，IOD值越高，所測得值的均值即分別為bcl-2和bax含量。

1.4統(tǒng)計學方法所有數(shù)據采用SPSS 16.0軟件包進行分析。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用兩組獨立樣本t檢驗，非正態(tài)計量資料采用中位數(shù)M （P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1大鼠神經功能缺損評分比較假手術組未見神經功能缺損表現(xiàn)，模型組和肌肽組均出現(xiàn)不同程度神經功能損傷；腦缺血后24 h，肌肽組與模型組神經功能評分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而腦缺血后72 h，肌肽組神經功能評分明顯低于模型組（P＜0.05）。見表1。

Tab.1　Comparison of neurological deficit score and infarct volume between three groups表1　各組大鼠神經功能評分及腦梗死體積的比較

2.2大鼠腦梗死體積比較假手術組無明顯梗死灶；模型組出現(xiàn)明顯梗死灶；肌肽組腦梗死體積較模型組明顯減小（P＜0.01）。見表1，圖1。

2.3大鼠損傷腦組織病理觀察假手術組：大鼠腦實質各層結構清晰，神經細胞未見腫脹、空泡變性，核正常，無核固縮，神經細胞未見壞死，形態(tài)結構正常，未見明顯的病理性損傷。模型組：大鼠大腦皮質神經元重度壞死，神經元數(shù)目明顯減少，細胞核固縮，胞體縮小變形，間質水腫，血管周間隙明顯增寬。肌肽組：大鼠大腦皮質神經元輕度變性壞死，神經元數(shù)目減少得到改善，細胞核固縮、胞體縮小變形、間質水腫、血管周間隙增寬得到明顯改善。見圖2。

Fig.1　TTC staining of rat brain tissue of three groups圖1　各組大鼠腦組織TTC染色結果

Fig.2　HE staining of rat brain tissue of three groups圖2　各組大鼠腦組織HE染色結果（HE染色，×400）

2.4bcl-2、bax蛋白表達及bcl-2/bax比較與假手術組比較，模型組bcl-2陽性表達明顯降低，bax陽性表達明顯升高，bcl-2/bax比值明顯降低，肌肽組bcl-2陽性表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，肌肽組bcl-2陽性表達明顯升高（P＜0.01），bax陽性表達明顯降低，bcl-2/bax比值明顯升高（P＜0.05）。見表2，圖3、4。

Tab.2　Comparison of the IOD values of bcl-2 and bax protein expression in cortex of rats between three groups表2　各組大鼠皮質區(qū)bcl-2及bax蛋白表達比較（n=4，±s）

Tab.2　Comparison of the IOD values of bcl-2 and bax protein expression in cortex of rats between three groups表2　各組大鼠皮質區(qū)bcl-2及bax蛋白表達比較（n=4，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別假手術組模型組肌肽組F bcl-2（IOD）19 846.60±5 443.00 8 009.20±1 881.20a28 417.00±6 901.80a b15.595＊＊bax（IOD）36 087.00±13 281.71 79 254.00±14 175.00a40 024.00±14 428.43b5.751＊bcl-2/bax 0.66±0.38 0.11±0.05a0.81±0.41b5.122＊

3　討論

3.1肌肽可改善腦缺血后繼發(fā)性的腦損傷腦缺血后繼發(fā)性的腦損傷是缺血性腦卒中最終致殘的關鍵因素，腦組織缺血、缺氧的病理生理改變最終導致神經元死亡和神經功能受損。腦梗死體積和神經功能缺損評分是評價腦缺血損傷的金標準［9］。本研究中模型組較假手術組出現(xiàn)明顯腦組織損傷和神經功能障礙，與有關報道一致［4-5］。

肌肽是一種由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的水溶性二肽，主要存在于脊椎動物的骨骼肌肉中，在腦組織及心肌中仍能檢測到肌肽［10］。肌肽是目前為止發(fā)現(xiàn)的結構最簡單的生物活性肽之一，具有抗氧化、抗炎、清除自由基、免疫調節(jié)等功能［11］。研究表明，肌肽對缺血性腦損傷具有保護作用，且具有劑量依賴性，1 000和2 000 mg/kg肌肽具有腦保護作用，但低劑量（500、750 mg/kg）是否具有腦保護作用尚存在爭議［4-5］，故本研究肌肽劑量選擇1 000 mg/kg。本研究顯示，肌肽可明顯改善神經功能缺損、減小腦梗死體積、改善腦組織病理損傷，具有腦保護作用?？紤]原因可能是肌肽具有抗氧化、清除自由基、抗炎等功能［11］。

3.2bcl-2和bax蛋白在腦缺血后神經細胞凋亡中的作用近年來研究表明，在腦缺血引起腦組織損傷進程中，有許多機制在起作用，如氧化應激、酸中毒、興奮性毒性、炎癥、細胞凋亡等［12］。細胞凋亡在缺血性腦損傷進程中可能起重要作用。bcl-2和bax是bcl-2基因家族中與細胞凋亡密切相關的兩種基因。當bcl-2表達增高時，可形成bcl-2-bax異源二聚體，抑制細胞凋亡；相反，當bax表達增高時，可形成bax/bax同源二聚體，促進細胞凋亡［13］。bcl-2和bax的比值能反映細胞受刺激后趨向于凋亡還是存活。當bcl-2表達增加，bax表達下降，兩者比值增加時，細胞趨向存活［3］。本研究中模型組bcl-2蛋白表達及bcl-2/bax比值較假手術組明顯下降，bax蛋白表達較假手術組明顯上升，表明腦缺血后細胞凋亡增加，與有關報道一致［9，14］。然而，關于肌肽能否調節(jié)bcl-2、bax蛋白表達及bcl-2/bax比值，目前研究不多。

3.3bcl-2、bax蛋白與肌肽腦保護機制的關系本研究中肌肽組bcl-2蛋白表達明顯高于假手術組和模型組，bax蛋白表達低于模型組，bcl-2/bax比值高于模型組，表明肌肽可抑制腦缺血后神經細胞凋亡，這與既往研究結果也一致［5，15］。其原因可能與肌肽調節(jié)bcl-2、bax蛋白表達，進而提高bcl-2/bax比值有關。與Cheng等［15］體外實驗不同，本研究通過在體實驗進一步證實前人研究結果。

綜上所述，肌肽可通過調節(jié)bcl-2、bax蛋白表達及bcl-2/bax比值而發(fā)揮腦保護作用，但肌肽發(fā)揮抗凋亡作用最佳干預時間及持續(xù)時間還需進一步探討。

（圖3、4見插頁）

［1］Beal CC.Gender and stroke symptoms:a review of the current literature［J］.J Neurosci Nurs，2010，42（2）:80-87.

［2］Colitti M.BCL-2 family of proteins and mammary cellular fate［J］. Anat Histol Embryol，2012，41（4）:237-247.doi:10.1111/j.1439-0264.2012.01134.x.

［3］Yang D，Guo S，Zhang T，et al.Hypothermia attenuates ischemia/reperfusion-induced endothelial cell apoptosis via alterations in apoptotic pathways and JNK signalings［J］.FEBS Lett，2009，583（15）: 2500-2506.doi:10.1016/j.febslet.2009.07.006.

［4］Bae ON，Serfozo K，Baek SH，et al.Safety and efficacy evaluation of carnosine，an endogenous neuroprotective agent for ischemic stroke［J］. Stroke，2013，44（1）:205-212.doi:10.1161/STROKEAHA.112.673954.

［5］Wang JP，Yang ZT，Liu C，et al.L-carnosine inhibits neuronal cell apoptosis through signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway after acute focal cerebral ischemia［J］.Brain Res，2013，1507:125-133.doi:10.1016/j.brainres.2013.02.032.

［6］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）: 84-91.

［7］Rajanikant GK，Zemke D，Senut MC，et al.Carnosine is neuroprotective against permanent focal cerebral ischemia in mice［J］.Stroke，2007，38（11）:3023-3031.

［8］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）:472-476.

［9］Li C，Wang GL，Wang HY，et al.A long-term neuroprotective effect of propofol on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Tianjin Med J，2011，39（4）:357-360.［李翠，王國林，王海云，等.丙泊酚后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的長時程保護作用［J］.天津醫(yī)藥，2011，39（4）: 357-360］.doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2011.04.024.

［10］Li YF，He RR，Tsoi B，et al.Anti-stress effects of carnosine on restraint-evoked immunocompromise in mice through spleen lymphocyte number maintenance［J］.Plos One，2012，7（4）:e33190.doi: 10.1371/journal.pone.0033190.

［11］Guiotto A，Calderan A，Ruzza P，et al.Carnosine and carnosine-related antioxidants:a review［J］.Curr Med Chem，2005，12（20）:2293-2315.

［12］Kao TK，Ou YC，Liao SL，et al.Opioids modulate post-ischemic progression in a rat model of stroke［J］.Neurochem Int，2008，52（6）: 1256-1265.doi:10.1016/j.neuint.2008.01.007.

［13］Hu ZL，Huang XP，Chen JX.Protective effects of epigallocatechin gallate on cerebral ischemia-reperfusion in rats［J］.China Journal of Modern Medicine，2010，20（11）:1627-1630.［胡宗禮，黃曉萍，陳珺霞.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2010，20（11）:1627-1630］.

［14］Wu DH，Wang GY.Effect of mild hypothermia in combination of acupuncture on Bcl-2 and Bax protein expressions of local cerebral ischemia/reperfusion rats［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2011，31（11）:1506-1509.

［15］Cheng J，Wang F，Yu DF，et al.The cytotoxic mechanism of malondialdehyde and protective effect of carnosine via protein cross-linking/ mitochondrial dysfunction/reactive oxygen species/MAPK pathway in neurons［J］.Eur J Pharmacol，2011，650（1）:184-194.doi:10.1016/j. ejphar.2010.09.033.

（2014-08-20收稿2014-10-27修回）

（本文編輯李鵬）

The influence of carnosine in expression levels of bcl-2 and bax after focal cerebral ischemia in rats

ZHU Jie，MA Qian，WANG Xin，LIU Cuimei，WANG Aihong△
Institute of Nursing，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China
△Corresponding AuthorE-mail：wah710630@163.com

ObjectiveTo explore the effect of carnosine in the expression of B cell lymphomal/leukemia-2（bcl-2）and bcl-2-associated X protein（bax）after focal cerebral ischemia in rats.MethodsThirty male SD rats（SPF scale）were randomly divided into 3 groups:sham-operated group，model group and carnosine treated group（n=10 for each group）.The middle cerebral artery occlusion model（MCAO）was induced in model group and carnosine treated group.Rats were received carnosine［1 000 mg/（kg·d），orally］in carnosine treated group，and the other rats were received the same volume of normal saline（NS）in shame-operated group and model group.The neurological deficit score was used to evaluate the neurological function at 24 h and 72 h after MCAO.Morphological changes were observed by HE staining.TCC staining was used to label infarct volume，and immunohistochemistry was used to detect the expression of bcl-2 and bax.ResultsCompared with model group，the score of neurological function and infarct volume were significantly declined in carnosine treated group at 72 h after injury（P＜0.05 or P＜0.01）.The changes of ischemic impairment were lighter in carnosine treated group than that of model group.Compared with sham-operated group，the expression levels of bcl-2 and the ratio of bcl-2/bax were decreased while the expression of bax was increased in model group（P＜0.05）.Compared with model group，carnosine could significantly increase the expression of bcl-2 and the ratio of bcl-2/bax，and reduce the expression of bax（P＜0.01 or P＜0.05）. ConclusionCarnosine can enhance bcl-2 expression，decrease bax expression and increase the ratio of bcl-2/bax，which is likely to be one of the mechanisms of neuroprotection.

carnosine；brain ischemia；genes，bcl-2；bcl-2-associated X protein；bcl-2/bax

R743.33

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.010

江蘇省青藍工程項目資助、江蘇省優(yōu)勢學科項目資助項目（YSHL0201-26）

南京中醫(yī)藥大學護理學院（郵編210023）

朱潔（1989），女，碩士在讀，主要從事腦血管疾病的基礎與臨床方面研究

△E-mail：wah710630@163.com