王彤，樸龍鎮(zhèn)，崔雪蓮，楊洋，南云澤△

Six1在宮頸癌組織中的表達(dá)及意義

王彤1，樸龍鎮(zhèn)1，崔雪蓮2，楊洋2，南云澤1△

目的探討Six1基因在宮頸癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)123例宮頸癌組織，49例宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）組織及32例正常宮頸組織中Six1蛋白的表達(dá)。體外培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞，免疫熒光染色觀察Six1蛋白在細(xì)胞中的定位。結(jié)果宮頸癌組織Six1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（72.3%）高于CIN （28.6%）及正常宮頸組織（15.6%），χ2分別為13.118，10.058（均P＜0.01）。不同腫瘤大小，淋巴結(jié)及血道轉(zhuǎn)移情況的宮頸癌組織中Six1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。Six1蛋白在HeLa細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞漿和核仁。結(jié)論Six1與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能成為宮頸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。

宮頸腫瘤；基因，同源盒；Six1；免疫組織化學(xué)；腫瘤浸潤(rùn)；腫瘤轉(zhuǎn)移；HeLa細(xì)胞

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女的健康。惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移在不同程度上影響著癌癥的進(jìn)展，其中腫瘤新生血管與逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別與破壞有重要意義，轉(zhuǎn)移過(guò)程中的“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”已成為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。同源盒基因家族中Six1基因在細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中具有重要的作用，并且在多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá)［1］。但有關(guān)宮頸癌中Six1表達(dá)的研究較少，本文旨在通過(guò)比較Six1蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá)情況，探討其在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象123例宮頸癌組織芯片購(gòu)自上海芯超公司，包括107例宮頸鱗癌、16例宮頸腺癌。49例宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）組織與32例正常宮頸組織取自延邊大學(xué)腫瘤研究中心。123例患者年齡34～66歲，中位年齡52歲，＜55歲者64例，≥55歲者59例。腫瘤直徑＜3 cm 71例，≥3 cm 52例。依據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)（FIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)：早期Ⅰ～ⅡA期76例，晚期ⅡB～Ⅳ期47例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例。血道轉(zhuǎn)移106例，無(wú)血道轉(zhuǎn)移17例。CIN及正常宮頸組織制成石蠟切片并HE染色，已由病理學(xué)專(zhuān)家確診。

1.2細(xì)胞及試劑人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)自上海通派生物科技有限公司，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。SP免疫組化試劑盒購(gòu)自丹麥Dako，牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自北京索萊寶，兔抗人Six1抗體購(gòu)自Sigma，羊抗兔IgG購(gòu)自Invitrogen，熒光染料49-6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）及抗熒光淬滅封片液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)所有標(biāo)本釆用SP法進(jìn)行免疫組化染色。操作步驟參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為保證檢測(cè)的特異性，分別應(yīng)用抗兔IgG和PBS代替一抗作為對(duì)照。

1.3.2判斷標(biāo)準(zhǔn)Six1蛋白陽(yáng)性染色呈棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞漿和核仁。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比例將染色結(jié)果分為3級(jí)。0級(jí)（陰性）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0～5%；1級(jí)（陽(yáng)性）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為6%～50%；2級(jí)（強(qiáng)陽(yáng)性）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)50%以上。計(jì)算1級(jí)和2級(jí)陽(yáng)性染色病例占總病例數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

1.3.3免疫熒光染色取24 mm×24 mm蓋玻片，泡酸過(guò)夜，純水洗滌，乙醇浸泡過(guò)夜、晾干，放入培養(yǎng)皿。取HeLa細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，取出玻片，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定10 min，0.5%Triton-X 100破膜10 min，3%BSA室溫封閉1 h。PBS沖洗后，兔抗人 Six1抗體（1∶100）4℃孵育過(guò)夜，次日用羊抗兔 IgG （1∶1 000）常溫孵育1 h，PBS沖洗后DAPI核染細(xì)胞。封片液封片后激光共聚焦顯微鏡觀察Six1在細(xì)胞中定位。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1免疫組化結(jié)果Six1陽(yáng)性染色主要位于胞漿與核仁，呈棕黃色顆粒，見(jiàn)圖1。宮頸癌組織中Six1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為72.3%（89/123），CIN及正常子宮上皮組織中Six1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為28.6%（14/ 49）和15.6%（5/32）。宮頸癌組織Six1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于CIN組織及正常宮頸組織（χ2分別為13.118和10.058，均P＜0.01）。CIN組與正常宮頸組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.295，P＞0.05）。

2.2宮頸癌組織中Six1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Six1在不同腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血道轉(zhuǎn)移情況間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），而在不同年齡、腫瘤分化程度以及臨床分期間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

Tab.1　Correlations of Six1 protein expression and the clinicopathological features in patients with cervical cancer表1　Six1蛋白在宮頸癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系　例（%）

2.3免疫熒光染色HeLa細(xì)胞中Six1蛋白主要定位于細(xì)胞漿和核仁，與免疫組化結(jié)果相一致，見(jiàn)圖2。

3　討論

Fig.1　Expression of Six1 protein in different cervical tissues（×200）圖1　Six1蛋白在不同宮頸組織中表達(dá)（×200）

腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要原因，早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移傾向?qū)⒂欣诨颊叩闹委熂邦A(yù)后。腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)包括細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的調(diào)控與細(xì)胞周期的調(diào)控，原癌基因與癌基因及其產(chǎn)物（生長(zhǎng)因子，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白等）。同源盒基因是控制機(jī)體發(fā)育的主要基因，對(duì)胚胎器官的發(fā)生和細(xì)胞分化調(diào)控起關(guān)鍵性作用［2］。根據(jù)同源盒結(jié)構(gòu)域的差異及基序的不同，將同源盒基因分為Hox、Msx、Pax、Lim、Six等幾個(gè)家族，其中對(duì)Six1的研究較為廣泛。Six1定位在染色體14q23，Six1蛋白在胚胎發(fā)生發(fā)育過(guò)程中主要促進(jìn)細(xì)胞增生、組織分化［3］。

Fig.2　Expression of Six1 protein in HeLa cells（×400）圖2　Six1蛋白在宮頸癌HeLa細(xì)胞中表達(dá)（×400）

既往研究表明Six1參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Coletta等［4］發(fā)現(xiàn)乳腺組織中Six1高表達(dá)可導(dǎo)致乳腺細(xì)胞惡變、轉(zhuǎn)移。Behbakht等［5］發(fā)現(xiàn)卵巢癌中高表達(dá)Six1，且Six1表達(dá)水平與卵巢癌患者的短期生存率相關(guān)。在肝癌和胰腺癌組織中也有類(lèi)似報(bào)道［6-7］。Wan等［8］通過(guò)人乳頭瘤病毒（HPV）誘導(dǎo)正常宮頸細(xì)胞癌變的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)Six1存在過(guò)表達(dá)，推測(cè)Six1是宮頸癌發(fā)展的潛在分子標(biāo)志物。Xu等［9］發(fā)現(xiàn)Six1過(guò)表達(dá)可通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑促進(jìn)宮頸上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中Six1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于CIN及正常宮頸組織，提示Six1蛋白可能參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，與Tan［10］的研究結(jié)果相一致。Six1蛋白在不同腫瘤大小、淋巴結(jié)、血道轉(zhuǎn)移情況的宮頸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率存在差異，提示Six1蛋白的過(guò)表達(dá)可能與宮頸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)，但不同臨床分期間Six1陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了Six1蛋白在宮頸癌細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞漿和核仁。

Six1蛋白的高表達(dá)可能參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，有望成為宮頸癌侵襲與轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。本研究的結(jié)論與Six1蛋白與其他腫瘤的關(guān)系類(lèi)似，追溯其生物學(xué)功能，推測(cè)Six1基因通過(guò)參與胚胎細(xì)胞的發(fā)育與分化，調(diào)控細(xì)胞周期，期間與相應(yīng)的不同分子或基因共同作用，導(dǎo)致細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)異常，進(jìn)而致其過(guò)表達(dá)，誘發(fā)腫瘤發(fā)生。其具體作用機(jī)制仍需深入研究與探討。

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（2014-10-20收稿2014-12-30修回）

（本文編輯胡小寧）

Expression and significance of Six1 in cervical cancer

WANG Tong1，PIAO Longzhen1，CUI Xuelian2，YANG Yang2，NAN Yunze1△
1 Department of Gynecology，Yanbian University Hospital，Yanji 133000，China；2 Department of Pathology，Yanbian University Medical College
△Corresponding AuthorE-mail:yznan@ybu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the clinical significance of protein expression of Six1 in cervical cancer.MethodsThe immunohistochemical（IHC）staining was applied to detect the expression of Six1 protein in normal cervical tissues（n=32），cervical intraepithelial neoplasia（CIN）tissues（n=49）and cervical cancer tissues（n=123）.The localization of Six1 protein was detected in vitro cultured HeLa cells using immunofluorescence（IF）staining.ResultsThe positive rate of Six1was significantly higher in cervical cancer（72.3%）than that of CIN tissues（28.6%）and normal cervical tissues（15.6%，χ2=13.118 and 10.058 respectively，P＜0.01）.There were significance differences in expression levels of Six1 protein between different tumor sizes and metastasis of cervical cancer（P＜0.01）.The Six1 protein showed positive signals in cytoplasm and nucleoli in HeLa cells.ConclusionSix1 expression is associated with cervical cancer，which may be a potential biomarker for invasion and metastasis of cervical cancer.

uterine cervical neoplasms；genes，homeobox；Six1；immunohistochemistry；neoplasm invasiveness；neoplasm metastasis；HeLa cells

R737.33

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.007

國(guó)家自然科學(xué)基金（61371067）；吉林省科技廳中青年科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（20130521017JH）

1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院婦科（郵編133000）；2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室

王彤（1987），女，醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤方面研究

△E-mail:yznan@ybu.edu.cn