于洋，劉學政△，包翠芬，李曉明，劉霞

實驗研究

人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血大鼠PARP-1和TNFR1表達的影響

于洋1，劉學政1△，包翠芬2，李曉明3，劉霞3

目的探討人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血大腦皮質多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）-1和腫瘤壞死因子受體（TNFR）1表達的影響。方法90只健康SD大鼠隨機均分為假手術組，單純缺血組，人參皂苷Rg1低、中、高組，陽性對照組。于術前5 d至取材當日，假手術組與單純缺血組分別腹腔注射生理鹽水45 mg/kg，人參皂苷Rg1分別給10、20、40 mg/kg，陽性對照組尼莫地平1 mg/kg。采用大腦中動脈栓塞法制備局灶性腦缺血模型，神經(jīng)功能缺損評分和TTC染色驗證模型是否成功；采用免疫組織化學法和蛋白免疫印跡法檢測大腦皮質缺血后PARP-1、TNFR1的表達。結果單純缺血組較假手術組可見明顯神經(jīng)功能缺陷癥狀及大面積蒼白色梗死區(qū)域；人參皂苷Rg1各組和陽性對照組神經(jīng)功能評分和腦梗死體積百分比高于假手術組，低于單純缺血組（P＜0.05）；人參皂苷Rg1各組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學意義。人參皂苷Rg1低組每高倍視野PARP-1、TNFR1陽性細胞數(shù)高于假手術組和陽性對照組；中、高組高于假手術組，低于單純缺血組（P＜0.05）。單純缺血組皮質PARP-1、TNFR1較假手術組陽性表達條帶顯著增強；人參皂苷Rg1低組PARP-1、TNFR1陽性表達高于假手術組；中組高于假手術組，低于單純缺血組；高組低于單純缺血組（P＜0.05）。結論人參皂苷Rg1對大鼠局灶性腦缺血具有保護作用，其機制可能與下調大腦組織PARP-1、TNFR1的表達，對抗腦細胞壞死有關。

人參皂甙；腦缺血；聚ADP核糖聚合酶類；受體，腫瘤壞死因子，Ⅰ型；人參皂苷Rg1；局灶性腦缺血；PARP-1；TNFR1

研究證實，局灶性腦缺血損傷時腦細胞可出現(xiàn)不同程度的細胞凋亡和細胞壞死現(xiàn)象［1］。以往研究認為，細胞壞死是由于某些原因對細胞造成嚴重損害所導致的一個被動過程，具有不可控性［2］。因此，對于局灶性腦缺血的防治主要集中于干預細胞凋亡過程，而局灶性腦缺血早期的壞死多伴有明顯的局部炎癥刺激，對腦組織的損害更為嚴重，單純地干預細胞凋亡過程對局灶性腦缺血的防治效果不甚理想［3］。近年來研究表明，某些形式的壞死是受到細胞信號通路的調控，多聚ADP核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase，PARP1）的過度激活以及腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）在壞死細胞中發(fā)揮的作用越來越引起人們的關注［4-5］。人參皂苷Rg1是從人參中提取的小分子活性物質，具有減小腦梗死體積、改善神經(jīng)功能缺損癥狀等腦保護作用，但是其作用機制還不明確。本研究通過制備動物局灶性腦缺血模型，并采用人參皂苷Rg1進行干預，觀察缺血后腦組織PARP-1、TNFR1的表達情況，探討Rg1對缺血損傷致腦細胞壞死的影響。

1　材料與方法

1.1材料人參皂苷Rg1（純度＞95%，由吉林大學有機化學教研室提供）；尼莫地平注射液（山西亞寶藥業(yè)，批號：071001）；羊抗鼠PARP-1（santa cruz公司）、兔抗鼠TNFR1單克隆抗體（abcam公司）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC；SIGMA公司）。

1.2方法

1.2.1分組與給藥健康 Sprague-Dawley大鼠，體質量（250±50）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證：SCXK（京）2012-0001。采用隨機區(qū)組法將大鼠分為6組：假手術組，單純缺血組，人參皂苷Rg1低、中、高組，陽性對照組，每組15只。術前5 d至取材當日，假手術組和單純缺血組分別給予腹腔注射生理鹽水（45 mg/kg），人參皂苷Rg1低、中、高組和陽性對照組分別給予腹腔注射人參皂苷Rg1（10、20、40 mg/kg）、尼莫地平（1 mg/kg），1次/d。

1.2.2大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型制備及鑒定采用改良線栓法制備右側大腦中動脈阻塞腦缺血模型［6］。用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，采用仰臥式頸正中切口，暴露頸總動脈（CCA）及右側頸內動脈（ICA）、頸外動脈（ECA），在CCA分叉處結扎ECA，夾閉CCA近心端及遠心端，在其近分叉處剪口，將線栓向ICA插入直至大腦中動脈起始處，以阻塞其開口。隨后，收緊預先留置于剪口處的絲線，松開CCA近心端動脈夾，逐層縫合。術中保持肛溫在37.0～37.5℃。假手術組除不插入線栓外，其他步驟同上。于大鼠蘇醒后進行神經(jīng)功能缺陷5分制評分，每組選取5只大鼠于術后24 h采用TTC染色以驗證局灶性腦缺損模型是否成功。

1.2.3光、電鏡標本的制備及染色取每組大鼠各5只，于MCAO術后24 h，采用2.5%多聚甲醛-戊二醛腦部灌流固定。冠狀切取前囟尾側頂葉大腦皮質，于灌流液中浸潤固定24 h。取小塊標本進行常規(guī)電鏡標本制備，其余部分制備成光鏡石蠟標本。石蠟標本經(jīng)切片后行焦油紫染色，光鏡下觀察腦組織病理改變，電鏡標本行超薄切片，重金屬雙染后，于透射電鏡下觀察腦細胞壞死情況。

1.2.4免疫組織化學法檢測及分析取上述石蠟標本制備5 μm防脫切片。采用Envision法進行免疫組化染色。切片常規(guī)脫蠟至水后，采用pH 6.0枸椽酸緩沖液高壓修復以恢復抗原活性，進一步以3%過氧化氫溶液消除內源性過氧化物酶反應；然后滴加1∶100稀釋的羊抗鼠PARP-1抗體/兔抗鼠TNFR1抗體，4℃孵育過夜；滴加辣根過氧化物酶標記的抗羊/抗兔多聚體，37℃孵育25 min；DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。陰性對照采用PBS替代一抗。

光鏡下觀察，PARP-1陽性表達部位定位于細胞核。TNFR1陽性表達部位定位于細胞質。采用細胞圖像分析系統(tǒng)檢測每400倍視野PARP-1、TNFR1的陽性細胞數(shù)量。

1.2.5蛋白免疫印跡法檢測及分析取每組大鼠各5只，于MCAO術后24 h，大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后迅速斷頭取出頂葉大腦皮質，勻漿粉碎，制成上清液。經(jīng)二喹啉甲酸法測定各組蛋白含量后，將上清液制備成樣品儲備液。取適量的樣品儲備液加入電泳槽內進行電泳、轉膜、半干轉印，采用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入一抗稀釋液（羊抗鼠PARP-1，兔抗鼠TNFR1，稀釋度為1∶1 000），4℃孵育過夜；加入辣根酶標記的抗羊/抗兔IgG抗體室溫孵育1 h。各步驟之間均采用TBST緩沖液洗脫3次×10 min。采用β-Actin作為內參照。電化學發(fā)光法顯色后，用UVP專用軟件分析各蛋白目的條帶與內參條帶吸光度的比值。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS 13.0軟件分析，計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1腦缺血神經(jīng)功能缺陷評分的比較假手術組未見神經(jīng)功能缺陷癥狀；單純缺血組可見明顯的神經(jīng)功能缺陷癥狀；人參皂苷Rg1各組和陽性對照組可見不同程度的神經(jīng)功能缺陷癥狀，其神經(jīng)功能評分均高于假手術組，低于單純缺血組（均P＜0.05）；人參皂苷Rg1各組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

Tab.1　Comparison of percentages of neurological function and infarct volume between six groups表1　各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死體積百分比比較（±s）

Tab.1　Comparison of percentages of neurological function and infarct volume between six groups表1　各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死體積百分比比較（±s）

＊P＜0.05；a與假手術組比較，b與單純缺血組比較，c與陽性對照組比較，P＜0.05；表2同

組別假手術組單純缺血組陽性對照組人參皂苷Rg1低組人參皂苷Rg1中組人參皂苷Rg1高組F神經(jīng)功能評分（n=15）0 2.87±0.35a1.20±0.41ab1.53±0.52ab1.33±0.49ab1.13±0.35ab82.340＊腦梗死體積百分比（%）（n=5）0 36.75±5.33a17.87±3.42ab20.44±2.82ab17.80±5.73ab15.77±2.53ab47.257＊

2.2腦梗死體積的比較正常腦組織被染成紅色，而缺血腦組織則被染成蒼白色。單純缺血組右側大腦皮質可見較大面積的蒼白色梗死區(qū)域，且與正常腦組織分界較明顯；人參皂苷Rg1各組和陽性對照組可見不同程度減小的蒼白色梗死區(qū)域，以人參皂苷Rg1高組減小最為明顯，見圖1。人參皂苷Rg1各組和陽性對照組腦梗死體積百分比均高于假手術組，低于單純缺血組（均P＜0.05）；人參皂苷Rg1各組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.3大腦皮質微細結構的比較光鏡下觀察可見假手術組右側大腦皮質結構完整、層次分明，細胞排列整齊；腦細胞形態(tài)結構正常。單純缺血組則可見細胞排列紊亂、稀疏，部分細胞變性壞死，胞質與胞核界限不清，核呈不規(guī)則形；進一步采用透射電鏡觀察，部分神經(jīng)元呈典型的壞死表現(xiàn)，核膜局部破損，核質外溢，細胞腫脹，內質網(wǎng)擴張，線粒體腫脹空泡化。人參皂苷Rg1各組和陽性對照組細胞排列較整齊，各項病理改變均較單純缺血組有不同程度的改善，見圖2。

2.4大腦皮質PARP-1、TNFR1免疫組化表達的比較假手術組可見少量PARP-1、TNFR1陽性細胞表達；單純缺血組皮質可見大量PARP-1、TNFR1陽性細胞表達；人參皂苷Rg1低組每高倍視野PARP-1、TNFR1陽性細胞數(shù)高于假手術組和陽性對照組（均P＜0.05），與單純缺血組差異無統(tǒng)計學意義；人參皂苷Rg1中、高組均高于假手術組，低于單純缺血組（均P＜0.05），與陽性對照組差異無統(tǒng)計學意義。見表2，圖3、4。

Tab.2　Comparison of positive cells and grey scale of PARP-1 and TNFR1 in rat cerebral cortex between six groups表2　各組大鼠大腦皮質PARP-1、TNFR1表達情況陽性細胞數(shù)及灰度比值比較?。╪=5，±s）

Tab.2　Comparison of positive cells and grey scale of PARP-1 and TNFR1 in rat cerebral cortex between six groups表2　各組大鼠大腦皮質PARP-1、TNFR1表達情況陽性細胞數(shù)及灰度比值比較?。╪=5，±s）

組別假手術組單純缺血組陽性對照組人參皂苷Rg1低組人參皂苷Rg1中組人參皂苷Rg1高組F PARP-1陽性細胞數(shù)（個/高倍視野）2.20±1.32 28.30±7.10a10.90±4.41ab21.14±6.35ac16.38±7.00ab12.50±3.27ab28.270＊TNFR1陽性細胞數(shù)（個/高倍視野）1.70±1.25 25.70±6.77a9.00±1.05ab16.98±4.37ac12.28±3.48ab10.40±2.84ab44.808＊組別假手術組單純缺血組陽性對照組人參皂苷Rg1低組人參皂苷Rg1中組人參皂苷Rg1高組F PARP-1灰度/ β-Actin灰度0.063 7±0.024 7 0.312 2±0.104 3a0.158 1±0.053 2b0.227 1±0.021 3a0.176 8±0.038 7ab0.153 7±0.039 8b6.931＊TNFR1灰度/ β-Actin灰度0.041 3±0.010 6 0.227 3±0.083 3a0.116 1±0.041 0b0.159 8±0.028 6a0.127 5±0.023 2ab0.111 2±0.031 8b6.088＊

2.5大腦皮質PARP-1、TNFR1蛋白免疫印跡表達水平的比較假手術組可見微弱的PARP-1、TNFR1陽性表達條帶；單純缺血組皮質PARP-1、TNFR1較假手術組陽性表達條帶顯著增強；人參皂苷Rg1低組PARP-1、TNFR1的表達均高于假手術組（均P＜0.05），與單純缺血組和陽性對照組差異均無統(tǒng)計學意義；人參皂苷Rg1中組高于假手術組，低于單純缺血組（均P＜0.05），與陽性對照組差異均無統(tǒng)計學意義；人參皂苷Rg1高組低于單純缺血組（均P＜0.05），與假手術組和陽性對照組差異均無統(tǒng)計學意義。見表2，圖5。

3　討論

局灶性腦缺血所引起的供血障礙可使局部腦組織發(fā)生缺血、缺氧，進一步引起組織損傷。其中在缺血半暗帶表現(xiàn)以細胞凋亡為主；而在缺血性腦損傷的中心區(qū)則以細胞壞死為主要特征。

近年來越來越多的證據(jù)表明，某些形式的壞死是受到細胞信號通路的調控。其中以腫瘤壞死因子-α（TNF-α）所介導的信號通路尤為重要［7-8］。TNF-α所誘導的多種生理或病理過程均依賴于細胞膜表面受體TNFR1和TNFR2的參與，二者均屬于TNF/神經(jīng)生長因子受體超家族成員，在胞外區(qū)具有多個富含半胱氨酸的結構。以三聚體形式存在的TNF-α結合TNFR1或TNFR2，導致受體三聚化，引發(fā)下游信號轉導。其中，TNF-α只有與擁有死亡結構域的TNFR1結合才能誘發(fā)細胞死亡［9］。細胞壞死的信號途徑包括啟動階段、傳導階段、執(zhí)行階段三個步驟。其中啟動階段可以通過死亡受體、PARP-1的過度活化等途徑介導，再經(jīng)傳導階段使信號得以放大，最終在執(zhí)行階段導致細胞壞死。PARP-1作為催化ADP核糖化的細胞核酶，可在DNA損傷時激活并對DNA結合蛋白進行聚ADP核糖化修飾，但過度活化的PARP-1可作用于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸并將其水解，導致其耗竭，最終引起細胞能量耗盡而引起細胞壞死。因此，目前PARP-1可作為檢測細胞壞死的標志性因子［10］。

人參皂苷Rg1是自中藥人參根、莖部分提取所得，研究證實該物質具有抗疲勞、抗衰老等神經(jīng)保護作用［11-13］。文獻證實，采用人參皂苷Rgl預處理后，缺血再灌注大鼠大腦皮質和海馬CA1區(qū)缺血半暗帶的凋亡神經(jīng)細胞數(shù)量顯著減少［14］。以上研究證實人參皂苷Rg1可能通過抑制細胞凋亡來發(fā)揮腦保護作用。而局灶性腦缺血早期因細胞壞死所致的腦損傷尤為嚴重，但是關于Rg1對于該種原因所致的細胞壞死的影響尚少見文獻報道。本研究結果表明，單純缺血組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺陷癥狀，且大腦皮質的PARP-1和TNFR1表達顯著增多；通過人參皂苷Rg1處理后，缺血大鼠神經(jīng)功能癥狀得到顯著改善，而大腦皮質PARP-1、TNFR1的陽性細胞數(shù)量顯著減少，免疫印跡結果也證實其陽性表達量顯著降低，其中以人參皂苷Rg1中、高組效果尤為明顯，提示中、高劑量的人參皂苷Rg1可能通過下調腦組織PARP-1、TNFR1蛋白的表達，減少細胞壞死數(shù)量，減輕由于壞死所致的的腦損傷，從而發(fā)揮腦保護作用。但是細胞壞死的調控機制是非常復雜的，人參皂苷Rg1通過何種途徑調控PARP-1和TNFR1的活性還有待于深入研究。

（圖1～5見插頁）

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（2014-10-17收稿2014-10-27修回）

（本文編輯陳麗潔）

Effects of ginsenoside Rg1 on PARP-1 and TNFR1 expression in rat model of focal cerebral ischemia

YU Yang1，LIU Xuezheng1△，BAO Cuifen2，LI Xiaoming3，LIU Xia3
1 Department of Human Anatomy，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2 Key Lab of Molecular Cell Biology and New Drug Development；3 Histology and Embryolog
△Corresponding AuthorE-mail：liuxuezheng168@vip.sina.com

ObjectiveTo explore effects of ginsenosides Rg1 on the expression of poly（ADP-ribose）polymerase-1（PARP-1）and tumor necrosis factor receptor（TNFR）1 in cortex cells after focal cerebral ischemia in rats.Methods Ninety healthy rats were randomly divided into sham-operative group，focal cerebral ischemia group，ginsenoside Rg1groups （low，medium and high concentrations）and drug control group.Rats were intraperitoneally injected saline 45 mg/kg，saline 45 mg/kg+ginsenosides Rg1 10，20 and 40 mg/kg，nimodipine 1 mg/kg 5 d before surgery，respectively.Focal cerebral ischemia model was made by middle cerebral artery occluding in rats.The neurological deficit score and TTC staining were used to verify the success of the rat model.The expressions of PARP-1 and TNFR1 were evaluated by immunohistochemical method and Western blot technique.ResultsThere were obvious symptoms of neurological deficit and large pale infarct area in focal cerebral ischemia group compared with those of sham-operative group.There were higher percentages of neurological deficit score and infarct area in ginsenosides Rg1 groups and positive control group than those of sham-operative group，but which were lower than those of ischemia group（P＜0.05）.There were no significant differences between ginsenosides Rg1 groups and positive control group.The positive cells of PARP-1 and TNFR1 were higher in ginsenosides Rg1 low-dose group than those of sham-operative group and positive control group，while ones of medium and high-dose Rg1 group were higher than those of sham-operative group，and were lower than those of ischemia group（P＜0.05）.Compared with sham-operative group，PARP-1 and TNFR1 expression strips were significantly enhanced in ischemia group.Expression strips werehigher in ginsenosides Rg1 low-dose group than those of sham-operative group.Expression strips were higher in ginsenosides Rg1 medium-dose group than those of sham-operative group，but which were lower than those of ischemia group，and ones of high-dose group were lower than ischemia group（P＜0.05）.ConclusionGinsenoside Rg1 shows protective effects on focal ischemia injury，which may be related with down-regulation of the expression of PARP-1 and TNFR1.

GINSENOSIDE；brain ischemia；poly（ADP-ribose）polymerases；receptors，tumor necrosis factor，type I；ginsenoside Rg1；focal cerebral ischemia；PARP-1；TNFR1

R743.3

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.006

國家自然科學基金資助項目（81202783）；遼寧省自然科學基金項目（2014022008）；遼寧省教育廳一般項目（LR2013092）

1遼寧醫(yī)學院解剖學教研室（郵編121000）；2省高校分子細胞生物與新藥開發(fā)重點實驗室；3組織胚胎學教研室

于洋（1980），女，碩士在讀，主要從事腦血管疾病防治的基礎研究

△E-mail：liuxuezheng168@vip.sina.com