陸斌，鄭全輝

鋅指蛋白185對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖影響的研究

陸斌1，鄭全輝2△

目的探討鋅指蛋白ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中的作用。方法標(biāo)本取自2011年1月—2013年12月于唐山市工人醫(yī)院就診，經(jīng)病理確診為膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織，以瘤旁組織作對(duì)照。提取不同組織總蛋白，Western-blot檢測(cè)ZNF185的表達(dá)。提取瘤旁組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增ZNF185編碼序列并克隆至pEGFPC2質(zhì)粒，構(gòu)建ZNF185表達(dá)載體。采用Lipofactamine2000將ZNF185表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SF767，以轉(zhuǎn)染pEGFPC2空載體細(xì)胞作為對(duì)照。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果與瘤旁組織相比，ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染ZNF185表達(dá)載體的膠質(zhì)瘤細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比ZNF185的表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；過(guò)表達(dá)ZNF185導(dǎo)致SF767細(xì)胞G0～G1期細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），而S期細(xì)胞比例減少（P＜0.05）。同時(shí)，過(guò)表達(dá)ZNF185也導(dǎo)致SF767細(xì)胞的增殖速度顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；細(xì)胞周期；細(xì)胞增殖；鋅指；轉(zhuǎn)染；ZNF185

神經(jīng)膠質(zhì)瘤亦稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是臨床上常見的腦惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、病死率較高，嚴(yán)重危害人類身體健康。膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是一個(gè)長(zhǎng)期的、多因素造成的發(fā)病過(guò)程。目前對(duì)造成膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制仍缺乏深入了解。近年來(lái)的分子遺傳學(xué)研究表明，癌基因或抑癌基因的表達(dá)異常在膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1］。鋅指蛋白（zinc finger protein，ZNF）185是一種c端含有LIM（Lin-1，Is1.1 and nec-3）結(jié)構(gòu)域的蛋白，盡管目前已知LIM結(jié)構(gòu)域蛋白在細(xì)胞分化、器官發(fā)育、細(xì)胞骨架組織以及腫瘤的發(fā)生等生物學(xué)過(guò)程中具有調(diào)控功能［2］。然而，對(duì)于ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不明確。為此，本研究通過(guò)檢測(cè)ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤和瘤旁組織的表達(dá)差異，探討ZNF185對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞周期和增殖的作用，為深入了解其發(fā)病機(jī)制提供線索。

1　材料與方法

1.1材料人腦膠質(zhì)瘤及瘤旁組織取自2011年1月—2013年12月于唐山市工人醫(yī)院就診，經(jīng)病理確診為膠質(zhì)瘤的20例患者。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SF767購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞生物所。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清（FBS）均購(gòu)自GIBCO公司；TRIzol試劑盒、Lipofactamine2000購(gòu)自Invitrogen公司；各種限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；兔抗人ZNF185一抗、兔抗人actin一抗，HRP-羊抗兔二抗購(gòu)自北京博奧森公司。Western-blot底物發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Pierce公司。pEGFPC2綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒由中科院動(dòng)物所趙勇研究員提供；蛋白提取試劑盒和Bio-Rad蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京天恩澤公司，引物由上海生物工程服務(wù)公司合成。氨基糖苷類抗生素G418、RNaseA、propidium iodide（PI）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1Western-blot檢測(cè)ZNF185的蛋白表達(dá)提取人腦膠質(zhì)瘤組織、瘤旁組織或膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF767總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。各取10 μg進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)（4℃、恒流300 mA、2 h）到硝酸纖維素膜（NC）上，然后將NC膜在含100 g/L脫脂奶的TBST中室溫封閉2 h，加兔抗人ZNF185一抗（1∶1 000）4℃過(guò)夜，TBST洗去未結(jié)合一抗，再加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫作用1 h，TBST洗滌3次后加ECL發(fā)光底物，室溫反應(yīng)1 min，暗室曝光。

1.2.2ZNF185表達(dá)載體構(gòu)建和質(zhì)粒提取瘤旁組織總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。PCR采用Pfx高保真DNA聚合酶和下列引物:上游5′-GGAATTCATGAGTATCTCAGCTCTTG-3′，下游5′-ACGCGTCGACTAGAAGAGCTTCTCATAGC-3′。上、下游引物分別加入EcoRⅠ/SalⅠ酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件：94℃2 min，然后94℃30 s，58℃45 s，72℃延伸1 min；30個(gè)循環(huán)，最后72℃孵育10 min，PCR產(chǎn)物膠回收并純化。EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pEGFPC2質(zhì)粒，回收純化酶切產(chǎn)物，并利用T4 DNA ligase將其連接在一起。轉(zhuǎn)化，挑克隆進(jìn)行序列測(cè)定。根據(jù)QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒的提取和純化。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SF767采用DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)。表達(dá)ZNF185和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用Lipofactamine2000，按操作說(shuō)明進(jìn)行。為獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZNF185的細(xì)胞，SF767細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后，用胰酶消化，1∶2分離培養(yǎng)過(guò)夜，加入G418（終濃度為600 mg/L）篩選抗性克隆，每3 d更換1次加G418的培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)1個(gè)月后，采用流式細(xì)胞儀分選綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，分別命名為EGFPC2-ZNF185和EGFPC2，在G418（200 mg/L）保持篩選壓力的條件下常規(guī)培養(yǎng)，并采用Westernblot檢測(cè)穩(wěn)定篩選細(xì)胞中ZNF185的表達(dá)。

1.2.4細(xì)胞周期測(cè)定將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFPC2-ZNF185和EGFP2空載體的SF767細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，在75%乙醇中固定過(guò)夜。PBS洗細(xì)胞，加100 g/L RNaseA，37℃孵育30 min。細(xì)胞重懸于0.5 mL PBS，加入propidium iodide染色30 min，以FACS分析PI熒光及周期分布。每個(gè)樣品收集2×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞增殖檢測(cè)分別將EGFPC2-ZNF185和EGFPC2空載體轉(zhuǎn)染SF767細(xì)胞，接種至96孔培養(yǎng)板（1×104/孔），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)孔。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。隨后分別于24、48、72、96和120 h每孔加25 μL MTT（10 g/L），于上述條件下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸凈培養(yǎng)液，每孔加 200 μL DMSO，放置5～10 min后，以DMSO作空白對(duì)照，用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定各孔的吸光度（A）值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，平均A值為縱軸，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SSPS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量為0.45±0.09，低于在瘤旁組織中的相對(duì)表達(dá)量為 1.47±0.19（t= 33.547，P＜0.01），見圖1。

Fig.1 ZNF185 protein expression in glioma and tumor adjacent tissues圖1人腦膠質(zhì)瘤和瘤旁組織中ZNF185的蛋白表達(dá)水平

2.2ZNF185基因表達(dá)載體的構(gòu)建和測(cè)序挑取ZNF185基因表達(dá)載體克隆測(cè)序。結(jié)果顯示，克隆cDNA包含全長(zhǎng)ZNF185編碼序列。此序列羧基端含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組成的LIM結(jié)構(gòu)域，氨基端為肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ATD），見圖2。

2.3ZNF185膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF767細(xì)胞周期Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染EGFPC2空載質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染EGFPC2-ZNF185的SF767細(xì)胞中ZNF185表達(dá)顯著增加（P＜0.01），見圖3a、b。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pEGFPC2空載質(zhì)粒的SF767相比，轉(zhuǎn)染EGFPC2-ZNF185質(zhì)粒的SF767處于DNA合成期（S期）的細(xì)胞比例顯著降低，而處于靜止G0～G1期的細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），見圖3c、d。

Fig.2 ZNF185 RT-PCR and sequencing of ZNF185 expression plasmid圖2 ZNF185反轉(zhuǎn)錄PCR和表達(dá)載體的克隆測(cè)序

2.4過(guò)表達(dá)ZNF185對(duì)SF767細(xì)胞增殖影響MTT結(jié)果顯示，EGFPC2-ZNF185組SF767細(xì)胞與對(duì)照EGFPC2組相比，A570值于第1天和第2天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而第3天至第5天A570值均顯著低于EGFPC2組（P＜0.05），見表1。

Tab.1　Comparison of the proliferation between differently tranfected SF767 cells表1　不同轉(zhuǎn)染組SF767細(xì)胞增殖的比較（n=3，±s）

Tab.1　Comparison of the proliferation between differently tranfected SF767 cells表1　不同轉(zhuǎn)染組SF767細(xì)胞增殖的比較（n=3，±s）

＊P＜0.05

組別EGFPC2 EHFPC2-ZNF185 t 24 h 0.13±0.01 0.12±0.01 2.031 120 h 0.78±0.02 0.45±0.05 5.436＊72 h 0.31±0.02 0.20±0.01 7.970＊96 h 0.55±0.03 0.32±0.04 8.690＊48 h 0.21±0.02 0.16±0.01 4.257

Fig.3　The effect of ZNF185 over expression on the cell cycle of SF767 cells圖3　過(guò)表達(dá)ZNF185對(duì)SF767細(xì)胞周期的影響

3　討論

3.1膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子機(jī)制人腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)高度惡性的腫瘤，據(jù)報(bào)道其5年生存率約為20%［3］。目前研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展與多種癌基因過(guò)度表達(dá)以及抑癌基因失活密切相關(guān)［4］。但目前對(duì)其發(fā)生、發(fā)展的精確分子機(jī)制尚不完全清楚。

3.2ZNF185發(fā)揮抑癌基因的作用ZNF是一類含Zn離子并具有手指狀結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Zhang等［5］報(bào)道ZNF185蛋白在人多種組織表達(dá)。Vanaja等［6］首先發(fā)現(xiàn)與正常前列腺組織相比，ZNF185在前列腺癌組織中的表達(dá)降低。且Medina等［7］發(fā)現(xiàn)ZNF185在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中表達(dá)也顯著降低。筆者近期研究結(jié)果表明，ZNF185在粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中與正常外周血粒細(xì)胞相比表達(dá)也顯著降低［8］。以上結(jié)果提示ZNF185可能在多種組織中發(fā)揮抑癌基因的作用。

3.3ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和功能本研究發(fā)現(xiàn)，與瘤旁組織相比，ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)顯著降低。在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SF767中過(guò)表達(dá)ZNF185，與對(duì)照組細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)ZNF185細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期G0～G1期阻滯，同時(shí)S期細(xì)胞減少，細(xì)胞增殖減慢。表明ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中也發(fā)揮抑癌基因的作用。

3.4ZNF185的可能表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)于ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)降低的原因及其發(fā)揮作用的機(jī)制目前還不清楚。通過(guò)對(duì)該基因上游調(diào)控序列的研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌和肺癌等組織中，ZNF185基因的啟動(dòng)子部位呈高度甲基化狀態(tài)［6，8］。另有報(bào)道表明，ZNF185的表達(dá)水平受染色質(zhì)重塑蛋白BRG1 （SNF復(fù)合體成分之一）的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)ZNF185隨BRG1表達(dá)的降低而降低［8］。研究發(fā)現(xiàn)，ZNF185通過(guò)其氨基端ATD結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞肌動(dòng)蛋白纖維系統(tǒng)的相互作用可能是其發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制之一［9］。以上結(jié)果為進(jìn)一步深入研究ZNF185在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控和作用機(jī)制提供了線索，并有待在今后研究中逐步加以解決。

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（2014-06-12收稿2014-10-16修回）

（本文編輯李鵬）

The effect of zinc finger protein 185 on the proliferation of human glioma cells

LU Bin1，ZHENG Quanhui2△
1 Tangshan Gongren Hospital，Tangshan 063000，China；2 Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Disease；School of Basic Medical Science，Hebei United University
△Corrsponding AuthorE-mail：zhqhdlp@sohu.com

ObjectiveTo explore the role of zinc finger protein（ZNF）185 in the proliferation of human glioma cells. MethodsHuman glioma tissues and tumor adjacent tissues were obtained from glioma patients diagnosed pathologically in Tangshan Gongren Hospital from January 2011 to December 2013.Total protein was extracted from different tissues.The ZNF185 expression was detected by Western-blot assay.Total RNA was extracted from tumor adjacent tissues.ZNF185 coding sequence was obtained by RT-PCR and inserted into pEGFPC2 plasmid to construct the ZNF185 expression vector.Lipofactamine2000 was used to transfect the ZNF185 expression vector to human glioma cell SF767.pEGFPC2 blank vector transfected SF767 cells were used as control.Changes of cell cycle were analyzed by flow cytometry，and cell proliferation was analyzed by MTT assay.ResultsThe expression of ZNF185 decreased significantly in human glioma tissues compared to that of tumor adjacent tissues（P＜0.01）.The over expression of ZNF185 in SF767 resulted in the increased proportion of cell cycle G0-G1phase，but decreased proportion of S phase（P＜0.05）.Furthermore，the cell proliferation was significantly inhibited in the ZNF185 over-expressed SF767 cells compared with that of blank vector transfected cells（P＜0.05）.ConclusionZNF185 plays an inhibitory role in cell proliferation of human brain glioma cells.

glioma；cell cycle；cell proliferation；zinc fingers；transfection；ZNF185

R739.41

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.005

河北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（H2013209019）；唐山市科技局指令性項(xiàng)目（13130290z）

1河北省唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)外科（郵編063000）；2唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

陸斌（1974），男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科學(xué)方面研究

△E-mail：zhqhdlp@sohu.com