史艷芬，牛 云，羅 杰，笪冀平

（中日友好醫(yī)院 病理科，北京 100029）

地砷病在全球發(fā)展較快，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，預(yù)防是這類(lèi)疾病最關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)，目前還未找到能有效防止血管損傷的藥物。本作者前期研究結(jié)果表明NaAsO2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡，HUVECs細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致血管損傷的基礎(chǔ)，氧化應(yīng)激可能是其發(fā)生的重要原因[1]。

人參皂苷 Rb1（Ginsenoside，Rb1）作為人參的主要成分之一，其內(nèi)含有能夠清除自由基的抗氧化物質(zhì)，發(fā)揮很多重要作用，其中包括：對(duì)很多種腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用；在抗衰老方面的功效，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷可以抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡還可以促進(jìn)血管再生[2]。所以人參皂苷Rb1對(duì)地砷病的預(yù)防和治療存在潛在價(jià)值。據(jù)報(bào)道人參皂苷Rg1對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用[3]；在研究人參皂苷抑制腦細(xì)胞凋亡作用時(shí)發(fā)現(xiàn)主要是通過(guò)減少NO產(chǎn)生，增加SOD活性[4]。此外，人參皂苷抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用機(jī)制可能與線粒體內(nèi)的膜電位降低有關(guān)[5]。本研究在前期工作中已經(jīng)證實(shí)，NaAsO2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在地砷病血管損傷中的重要作用，而人參皂苷Rb1保護(hù)血管損傷的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

維生素B12（Vitamin B12）是一種含鈷的微量元素，在人和動(dòng)物體內(nèi)必不可少。當(dāng)人體缺乏該維生素時(shí)可導(dǎo)致血液異常，認(rèn)知紊亂，及神經(jīng)病等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。VB12來(lái)源于動(dòng)物性食物，它的缺乏與飲食，吸收和代謝改變有關(guān)。有報(bào)道，維生素B12和葉酸共同作用于冠心病防治研究[6～8]。關(guān)于維生素B12對(duì)砷誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）系來(lái)源于ATCC細(xì)胞庫(kù)。Rhodamine123和活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天，IMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，人參皂苷Rb1由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院化學(xué)系贈(zèng)送，維生素B12（Vitamin B12）購(gòu)于鼎國(guó)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取出保存在液氮中的HUVECs細(xì)胞，立即在水浴鍋中快速搖動(dòng)至凍存液融化50%以上時(shí)，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)操作。用移液器將凍存管內(nèi)含細(xì)胞的凍存液移入離心管，加入IMEM 5ml混勻，1000 rpm，離心5min，棄上清。加含10%胎牛血清IMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀，輕吹混勻，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加5ml含10%胎牛血清培養(yǎng)液放置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 亞砷酸鈉溶液的制備

亞砷酸鈉（NaAsO2）是一種白色粉末，易溶于水，分子量為129.91。用電子天平稱量NaAsO2粉末0.6495g，溶于裝有10ml IMDM（含10%胎牛血清）的小青瓶中，振蕩混勻，使NaAsO2充分溶解，得到NaAsO2溶液濃度為0.5mol/L，用不加血清的IMDM培養(yǎng)基稀釋成NaAsO2濃度為20μM的工作液。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

常規(guī)培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞經(jīng)酶消化后以5.0×105/ml的細(xì)胞密度接種于6cm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2條件下生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至指數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)，加入已經(jīng)用IMEM培養(yǎng)基配制好的不同濃度藥物溶液并進(jìn)行分組：

①NaAsO2誘導(dǎo)組：加入上述NaAsO2儲(chǔ)存液使其終濃度為20μM。

②人參皂苷Rb1組（儲(chǔ)存濃度為4mg/ml）：用20μM NaAsO2溶液分別配制成 1.25μg/ml組、2.5μg/ml組、5μg/ml組。 Vitamin B12組（儲(chǔ)存濃度為50mg/ml）：用20μM NaAsO2溶液分別配制成5μg/ml組、10μg/ml組、20μg/ml組、40μg/ml組。人參皂苷Rb1與Vitamin B12共同作用組：1.25μg/ml人參皂苷 Rb1+10μg/ml Vitamin B12組 （混合 1）；2.5μg/ml人參皂苷 Rb1+20μg/ml Vitamin B12組（混合 2）；5μg/ml人參皂苷 Rb1+40μg/ml Vitamin B12組（混合 3）。

③對(duì)照組：加入等體積IMEM培養(yǎng)基。以上細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，接著用這些制備好的細(xì)胞檢測(cè)凋亡和活性氧 （reactive oxidative species，ROS）水平。

1.5 Annexin V-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集各組細(xì)胞分別放于1.5ml的EP管中，1500rpm離心5min；去掉上清液，用0.1M的冷PBS緩沖液（4℃預(yù)冷）沖洗 3次；加入 500μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5μl Annexin VFITC，混勻；4℃、避光、孵育 15min；再加入 10μl PI， 混勻；4℃、避光、孵育 5min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 DCFH-DA活性氧檢測(cè)

收集各組細(xì)胞分別放于1.5ml的EP管中，1500rpm離心5min；去掉上清液，用0.1M的PBS緩沖液沖洗3次，在每個(gè)EP管中各加入500μl用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋得到濃度為10μM的DCFH-DA，充分混勻；避光、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱、孵育20 min；每隔3～5min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸；孵育完畢后，再用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFHDA；把準(zhǔn)備好的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0版軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rb1保護(hù)NaAsO2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡

圖1人參皂苷Rb1對(duì)HUVECs損傷的保護(hù)作用

圖2 維生素B12對(duì)HUVECs損傷的保護(hù)作用

作者在前期研究中已證實(shí)，NaAsO2誘導(dǎo)HUVECs凋亡，為了研究人參皂苷Rb1是否保護(hù)HUVECs凋亡，本實(shí)驗(yàn)在NaAsO2的基礎(chǔ)上加入不同濃度人參皂苷Rb1，結(jié)果如圖1所示：人參皂苷組細(xì)胞凋亡率明顯低于NaAsO2作用組 （P＜0.05），且凋亡細(xì)胞率隨著人參皂苷濃度的增加而降低，表明人參皂苷Rb1可以降低NaAsO2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

2.2 維生素B12保護(hù)NaAsO2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡

為了研究維生素B12是否會(huì)保護(hù)HUVECs，本實(shí)驗(yàn)在NaAsO2的基礎(chǔ)上加入不同濃度維生素B12，結(jié)果如圖 2所示：10μg/ml以下濃度組與NaAsO2作用組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），10μg/ml濃度以上的維生素 B12組（包含 10μg/ml）細(xì)胞凋亡率低于NaAsO2作用組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且凋亡細(xì)胞率隨著維生素B12濃度的增加而降低，表明維生素B12≥10μg/ml可以降低NaAsO2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

2.3 人參皂苷Rb1和維生素B12聯(lián)合作用保護(hù)NaAsO2誘導(dǎo) HUVECs凋亡

人參皂苷Rb1能保護(hù)NaAsO2誘導(dǎo)HUVECs損傷，維生素B12同樣能保護(hù)NaAsO2誘導(dǎo)HUVECs損傷，如果兩者共用是否會(huì)有協(xié)同作用，本實(shí)驗(yàn)在NaAsO2的基礎(chǔ)上加入不同濃度二者混合物，結(jié)果如圖3所示：二者混合物組細(xì)胞凋亡率顯著低于NaAsO2作用組（P＜0.01），且凋亡細(xì)胞率隨著混合物濃度的增加而降低，表明二者混合物可以明顯降低NaAsO2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，且二者具有一定的相加作用。

圖3 二者混合物對(duì)HUVECs損傷的保護(hù)作用

圖4 人參皂苷Rb1對(duì)NaAsO2改變HUVECs ROS生成的影響

圖5 維生素B12對(duì)NaAsO2誘導(dǎo)HUVECs ROS生成的影響

圖6人參皂苷Rb1和維生素B12共用對(duì)NaAsO2誘導(dǎo)HUVECs ROS生成的影響

2.4 人參皂苷Rb1對(duì)NaAsO2誘導(dǎo) HUVECs內(nèi)ROS生成的影響

人參皂苷組孵育細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS含量。如圖4可見(jiàn)：在NaAsO2溶液中加入不同濃度的人參皂苷后，與NaAsO2組相比均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），具有劑量效應(yīng)關(guān)系。這一結(jié)果提示人參皂苷Rb1具有抗氧化應(yīng)激活性。

2.5 維生素B12對(duì)NaAsO2誘導(dǎo) HUVECs內(nèi)ROS生成的影響

維生素B12組孵育24h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVECs內(nèi)ROS含量。如圖5可見(jiàn)：10μg/ml以下濃度組與NaAsO2作用組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），10μg/ml濃度以上的維生素 B12組 （包含 10μg/ml）與 NaAsO2組相比，均能降低細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。這一結(jié)果說(shuō)明維生素B12能降低ROS的產(chǎn)生，提示具有抗氧化應(yīng)激活性。

2.6 人參皂苷Rb1和維生素B12聯(lián)合作用對(duì)NaAsO2誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生ROS水平的影響

人參皂苷Rb1降低NaAsO2誘導(dǎo)HUVECs內(nèi)ROS的水平，維生素B12同樣降低HUVECs損傷后細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，為探討二者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，本實(shí)驗(yàn)在NaAsO2的基礎(chǔ)上加入不同濃度的二者混合物（具體見(jiàn)分組），結(jié)果如圖6所示：二者混合物組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著低于NaAsO2作用組（P＜0.01），且 ROS 隨著混合物濃度的增加而顯著降低，具有劑量效應(yīng)關(guān)系。表明二者混合物可以顯著降低NaAsO2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)二者不具有相加作用（P＞0.05）。

3 討論

地砷病患者長(zhǎng)期處于高砷環(huán)境中，根據(jù)大量流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，這類(lèi)患者早期主要表現(xiàn)為周?chē)芗膊?、皮膚損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等以血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡為基礎(chǔ)的一類(lèi)疾病。其原因可能是高濃度砷觸發(fā)了內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，更早地啟動(dòng)了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡程序，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能發(fā)生紊亂和損傷，從而阻礙細(xì)胞的正常增殖。

線粒體產(chǎn)生活性氧自由基 （ROS），ROS再作用線粒體，造成線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)及功能損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在前期研究中我們已經(jīng)證明NaAsO2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡主要通過(guò)線粒體途徑[1]。

本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞，建立由高砷誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，同時(shí)分別加入不同濃度的人參皂苷Rb1及維生素B12進(jìn)行干預(yù)。研究結(jié)果顯示，20μM亞砷酸鈉導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率遠(yuǎn)大于正常對(duì)照組，且同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞釋放的ROS含量明顯增加，提示高濃度砷激活氧化產(chǎn)物，從而明顯加劇血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。而在高濃度砷作用組中分別加入不同濃度人參皂苷Rb1、維生素B12及二者混合液，能顯著降低受損細(xì)胞的ROS含量，并減少高濃度砷導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。證實(shí)了人參皂苷Rb1及維生素B12分別對(duì)HUVECs細(xì)胞有一定保護(hù)作用，且二者混合作用更佳。

人參皂苷Rb1作為中藥人參中主要成分之一，具有提高機(jī)體免疫力、抗衰老、抗癌、抗輻射、抗缺氧多方面的功效成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。在抗癌方面，相關(guān)研究在肺癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌等發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制主要表現(xiàn)在：人參皂苷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9～11]；使腫瘤細(xì)胞周期停滯[12]。而在非腫瘤方面的研究顯示，人參皂苷Rb1的作用主要參與了體內(nèi)的氧化應(yīng)激通路，如人參皂苷可抑制多巴胺誘導(dǎo)PC12細(xì)胞內(nèi)NO的生成，從而降低該細(xì)胞內(nèi) ROS含量來(lái)保護(hù) PC12細(xì)胞的[13，14]；人參皂苷Rb1可以有效提高黑素瘤細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的作用[15]。在波動(dòng)性高糖導(dǎo)致HUVEC細(xì)胞凋亡過(guò)程中，人參總皂苷通過(guò)增強(qiáng)SOD活性保護(hù)HUVEC細(xì)胞的損傷[16]。本實(shí)驗(yàn)選取人參總皂苷Rb1為干預(yù)藥物，結(jié)果亦證實(shí)了其有效清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的自由基，阻止自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物過(guò)度產(chǎn)生的功效。提示其可能通過(guò)促使某些細(xì)胞凋亡抑制基因高表達(dá)而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而能在高濃度砷中增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化和抗凋亡的能力，對(duì)細(xì)胞膜和線粒體膜起到保護(hù)作用。

維生素B12的研究主要集中在冠心病方面，最近有文獻(xiàn)報(bào)道在大鼠實(shí)驗(yàn)中，維生素B12和葉酸能保護(hù)砷誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[17]，Majumdar等[18]也證實(shí)維生素B12和葉酸合用能保護(hù)砷誘導(dǎo)的線粒體和DNA損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)，維生素B12在高濃度砷環(huán)境中有效保護(hù)NaAsO2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，此結(jié)果主要是通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)ROS水平實(shí)現(xiàn)；人參皂苷Rb1和維生素B12聯(lián)合使用后顯著降低了HUVEVs細(xì)胞的凋亡，有效保護(hù)了亞砷酸鈉對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。由于大量產(chǎn)生的自由基所引起的氧化損傷和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，是引起地砷病早期血管病變的重要因素，因此，清除體內(nèi)自由基是預(yù)防地砷病血管并發(fā)癥的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)為探索人參皂苷Rbl及維生素B12在延緩地砷病血管疾病方面的良好應(yīng)用前景提供了理論基礎(chǔ)。但由于目前對(duì)高濃度砷產(chǎn)生氧化應(yīng)激的通路及細(xì)胞凋亡機(jī)制尚不明確，因此有待更深入的研究予以證實(shí)。

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