黃榮，聶小琴，董發(fā)勤，張東，亢武，楊杰，馬佳林，周嫻，龔運(yùn)軍，龔俊源

(1 西南科技大學(xué)核廢物與環(huán)境安全國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽 621010；2 中國工程物理研究院核物理與化學(xué)研究所，四川 綿陽 621900)

引 言

在過去的幾十年，伴隨著核工業(yè)的迅速發(fā)展，大規(guī)模的鈾礦開采和冶煉過程產(chǎn)生了大面積低濃度的鈾污染水體，鈾通過地表徑流和地下滲透的方式進(jìn)入到地表水和地下水，再經(jīng)過生物鏈進(jìn)入到身體，以其化學(xué)和放射性雙重毒性對人類健康和環(huán)境安全造成潛在的危害[1-2]。針對這類鈾污染水體，傳統(tǒng)的化學(xué)沉淀、離子交換、蒸發(fā)等處理方法都存在成本高、易造成二次污染等問題。近二十年來，利用微生物高效原位地凈化和修復(fù)鈾污染水體已引起國內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。大量關(guān)于活體或死體細(xì)菌[1-3]、真菌[4-7]、微藻[8-10]、植物組織[11]吸附去除水體中U(Ⅵ)的報(bào)道，涉及到的作用機(jī)理包括物理化學(xué)吸附、氧化還原、離子交換、絡(luò)合沉淀等[12-16]。最近一些研究表明[17-19]，鈾主要與微生物表面的磷酸基團(tuán)發(fā)生作用，提供絡(luò)合配位的主要位點(diǎn)，甚至在一些活體微生物表面沉淀礦化為片狀或針狀的磷-鈾晶體，存在微生物體內(nèi)部分有機(jī)磷被分解并從胞內(nèi)釋放出無機(jī)磷的可能。然而，關(guān)于微生物在與U(Ⅵ)作用過程中，磷的釋放行為很少被關(guān)注。本文采用靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)，研究了枯草芽孢桿菌對水體中U(Ⅵ)的吸附熱力學(xué)和動力學(xué)，同時考察了鈾的解吸行為及菌體內(nèi) P 的釋放過程，并利用SEM-EDS 和FTIR 對吸附機(jī)理進(jìn)行了分析。本研究將有助于深入理解微生物與鈾相互作用過程及其機(jī)制，以期為微生物原位修復(fù)鈾污染水體的應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。菌種解凍后，接種到液體培養(yǎng)基中，在35℃、150 r·min-1的恒溫培養(yǎng)箱中振蕩24 h，得到活化菌體，通過平板劃線法得到單個長勢好的菌落，挑選茁壯的菌落接種到新的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)此步驟2～3 次，得到長勢好的枯草芽孢桿菌菌體。將活化后的枯草芽孢桿菌接入到液體培養(yǎng)基中，150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)48 h（35℃），離心，取沉淀的菌體，用0.9% 的生理鹽水稀釋為所需菌懸液（吸光度值OD600=0.5）。

培養(yǎng)基成分：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1000 ml，pH：7.0～7.2。

1.1.2 鈾溶液的配置 準(zhǔn)確稱取 2.1092 g UO2(NO3)2·6H2O，少量水溶解后，加入10 ml 硝酸，移入1000 ml 容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即為鈾濃度為1 g·L-1的鈾溶液。通過稀釋得到實(shí)驗(yàn)所需的濃度。以去離子水體系作為對照。采用0.1 mol·L-1HNO3、10 g·L-1Na2CO3和5 g·L-1NaHCO3調(diào)節(jié)溶液pH。

1.1.3 分析測試儀器 電子天平（AL104），梅特勒-托力多儀器有限公司；真空干燥箱（BZF-50），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫水浴搖床（SHA-B），常州國華電器有限公司；pH 計(jì)（PHS-3C），上海雷磁儀器廠；離心機(jī)（LD5-2B），北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（CL-32L）,日本ALP 公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-1600），上海美譜達(dá)儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），美國PE 儀器公司；場發(fā)射掃描電子顯微鏡系統(tǒng)（Ultra55），德國蔡司儀器公司；能譜儀（Oxford IE450），英國Oxford 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確移取20 ml 一定濃度的鈾溶液于50 ml 錐形瓶中，取20 ml 預(yù)培養(yǎng)好的菌懸液（OD600=0.5）離心（4000 r·min-1）10 min，將離心后的濕菌體（干重2.5～5.0 mg）分別加入上述50 ml 錐形瓶中（每組設(shè)置3 個平行樣），置于搖床內(nèi)恒溫振蕩吸附一定時間，離心，取5 ml 上清液利用偶氮胂Ⅲ分光光度法[20]測定殘余鈾濃度，參照文獻(xiàn)[21]測定溶液中的磷濃度。離心后的菌體通過20 ml 飽和EDTA 解吸3 次，每次2 h，解吸出的鈾被認(rèn)為是在細(xì)胞表面吸附絡(luò)合的U(Ⅵ)。通過式（1）、式（2）計(jì)算枯草芽孢桿菌對鈾(Ⅵ)的吸附率R（%）和吸附量q（mg·g-1）。

式中，C0為初始U(Ⅵ)濃度，mg·L-1；Ce為t時刻剩余U(Ⅵ)濃度，mg·L-1；V為溶液體積，L；m為枯草芽孢桿菌細(xì)胞干重，g。

將部分濕菌體用蒸餾水清洗3 次，離心、制成菌懸液，稀釋，在蓋玻片上點(diǎn)樣，自然干燥，經(jīng)2.5%戊二醛溶液固定10 h，再通過30%、50%、70%、90%、100%乙醇溶液逐級脫水（每次脫水20 min），自然晾干，備用。樣品經(jīng)過噴金處理后進(jìn)行掃描電鏡分析。

將清洗后的剩余菌體在65℃下烘至恒重，收集作為紅外光譜分析樣品。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 溶液pH 對枯草芽孢桿菌吸附U(Ⅵ)的影響

大量研究表明，pH 通過影響溶液中U(Ⅵ)的化學(xué)形態(tài)以及微生物表面電荷分布，從而影響微生物對U(Ⅵ)的吸附行為。

圖1 pH 對枯草芽孢桿菌吸附U(Ⅵ)的影響Fig.1 Effect of pH on adsorption of U(Ⅵ) by Bacillus subtilis

由圖1可以看出，在pH=1～5 時吸附率隨pH增大而升高，在此pH 范圍內(nèi)，鈾主要以UO22+形式存在，當(dāng)pH＞4 時，伴有少量的(UO2)2(OH)22+、UO2OH絡(luò)合陽離子。因?yàn)榭莶菅挎邨U菌生長和存活最適宜的pH 在5 左右，此時細(xì)胞相對活性最高，也表現(xiàn)出最大的吸附率，當(dāng)pH＞5 時，UO22+水解加劇，形成大量的 UO2(OH)+、(UO2)2(OH)22+、(UO2)3(OH)5+，由于較大的離子半徑，導(dǎo)致與細(xì)胞表面活性位點(diǎn)結(jié)合的空間位阻較大[5]，引起吸附率下降。

2.2 加菌量對枯草芽孢桿菌吸附U(Ⅵ)的影響

由圖2可知，吸附率與所加菌體量呈正相關(guān)，隨菌體量增多，溶液中可參與吸附作用的活性位點(diǎn)增多[1]，導(dǎo)致吸附率逐漸增大，而相應(yīng)的吸附容量逐漸降低。在初始鈾濃度為50 mg·L-1，pH=5，投加量為1.384 mg·L-1時，吸附率和吸附量分別為85.34%和308.31 mg·g-1（DW）；當(dāng)投加量增加至6.92 mg·L-1時，吸附率和吸附量分別為96.86%和70.01 mg·g-1（DW）。

圖2 加菌量對枯草芽孢桿菌吸附U(Ⅵ)的影響Fig.2 Effect of bacteria content on adsorption of U(Ⅵ) by Bacillus subtilis

2.3 溫度對枯草芽孢桿菌吸附U(Ⅵ)的影響

溫度對枯草芽孢桿菌吸附U(Ⅵ)的影響如圖3所示。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的溫度范圍內(nèi)，枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附量隨溫度的變化不大。在溫度低于303 K 時，吸附率與溫度呈正線性關(guān)系，溫度從288 K升高到303 K 時，吸附率增加17.51%，繼續(xù)升高溫度至313 K，吸附率基本保持不變，說明在288～303 K 溫度范圍內(nèi)，升高溫度有利于枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附，但溫度對整體吸附過程的影響不太顯著。

2.4 初始鈾濃度對枯草芽孢桿菌吸附U(Ⅵ)的影響

圖3 溫度對枯草芽孢桿菌吸附U(Ⅵ)的影響Fig.3 Effect of temperature on adsorption of U(Ⅵ) by Bacillus subtilis

圖4 初始鈾濃度對枯草芽孢桿菌吸附U(Ⅵ)的影響Fig.4 Effect of initial uranium concentration on adsorption of U(Ⅵ) by Bacillus subtilis

如圖4所示，隨著初始鈾(Ⅵ)濃度的增加，枯草芽孢桿菌對鈾(Ⅵ)的吸附率逐漸降低，吸附量呈 增加趨勢，但鈾(Ⅵ)濃度大于71.72 時吸附量有減少趨勢。在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的鈾(Ⅵ)濃度范圍內(nèi)，吸附率在9.92%～84.24%之間，吸附量為57.82～319.62 mg·g-1；表明枯草芽孢桿菌更適宜處理濃度低于71.72 mg·L-1的含鈾廢水。

2.5 枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附熱力學(xué)分析

2.5.1 吸附等溫模型 Langmuir 等溫吸附模型基于單層吸附理論，假定吸附劑上的吸附位點(diǎn)是均勻分布的并且溶質(zhì)單層覆蓋在吸附劑的表面，F(xiàn)reundlich 等溫吸附方程假定吸附劑表面為不均勻的[10]。Langmuir 和Freundlich 線性表達(dá)式見式（3）和式（4）

式中，Ka是Langmuir 吸附等溫模型的平衡常數(shù)，L·mg-1，表示吸附與解吸的比率；qm表示理論最大吸附量，mg·g-1；qe表示平衡吸附量，mg·g-1；Ce表示溶液中剩余鈾濃度，mg·L-1；Kf是Freundlich 常數(shù)，表示吸附劑的吸附能力；1/n為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，表示吸附強(qiáng)度。

枯草芽孢桿菌對水體中U(Ⅵ)的吸附等溫模型擬合結(jié)果見表1和圖5。

從表1和圖5可以看出，在298 K、308 K 和318 K 時，Langmuir 方程擬合效果均好于Freundlich方程，R2在0.955～0.988 之間，Ka值在 0～1 范圍內(nèi)，吸附反應(yīng)容易進(jìn)行[10]。枯草芽孢桿菌對放射性核素鈾(Ⅵ)的理論最大吸附量為344.82 mg·g-1，鈾的吸附主要發(fā)生在特定活性位點(diǎn)的單層吸附。

圖5 枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附等溫模型Fig.5 Isotherm model of uranium adsorption by Bacillus subtilis

2.5.2 吸附熱力學(xué) 由式（5）、式（6）計(jì)算反應(yīng)的焓變(ΔH°)、反應(yīng)物和產(chǎn)物之間熵的變化(ΔSo)、Gibbs 自由能變化(ΔG)，其中K=q/Ce，R=8.314 J·mol-1·K-1。ΔHo＞0，為吸熱反應(yīng)，反之為放熱反應(yīng)；ΔSo＞0 說明系統(tǒng)混亂度增加；ΔG＜0 表明該吸附反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行，反之該吸附反應(yīng)不能自發(fā)進(jìn)行。

表1 枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附等溫常數(shù)Table 1 Adsorption isotherm constants of uranium biosorption by Bacillus subtilis

表2 枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters for uranium adsorption by Bacillus subtilis

枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附熱力學(xué)常數(shù)見表2。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附過程是吸熱的，自發(fā)進(jìn)行的，隨著反應(yīng)的發(fā)生系統(tǒng)混亂度增加。

2.6 枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附動力學(xué)

2.6.1 吸附與解吸 枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附及解吸隨時間的變化如圖6所示。

由圖6可以看出，吸附是一個較迅速的過程，5 min 和2 h 時吸附率分別為61.66% 和 85.07%，吸附趨于平衡，在48 h 時平衡吸附率為 89.95%，吸附量為324.94 mg·g-1。而相應(yīng)的解吸率逐漸降低，由5 min 的80.06% 降至48 h 的36.25%，推測初始階段的快速吸附主要為物理靜電吸附，表現(xiàn)為在初始階段大部分吸附在枯草芽孢桿菌上的鈾容易被EDTA 交換洗脫下來。隨著吸附時間的延長，吸附在枯草芽孢桿菌表面的鈾與菌體發(fā)生生物及化學(xué)作用，在活性位點(diǎn)絡(luò)合配位，被還原及礦化，甚至穿透細(xì)胞壁膜進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)。

2.6.2 吸附動力學(xué) 根據(jù)上述吸附數(shù)據(jù)，本文對枯草芽孢桿菌吸附U(Ⅵ)的動力學(xué)過程進(jìn)行了擬合，式（7）和式（8）分別為準(zhǔn)一級動力學(xué)方程和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程的線性表達(dá)式

圖6 時間對枯草芽孢桿菌吸附和解吸U(Ⅵ)的影響Fig.6 Effect of time on adsorption（a）and desorption（b）of U(Ⅵ) by Bacillus subtilis

式中，qe和qt分別為平衡吸附量及t時刻的吸 附量，mg·g-1；k1(h-1)和k2（g·mg-1·h-1）分別表示準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程的速率常數(shù)。

枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附動力學(xué)擬合結(jié)果見表3和圖7。

由表3和圖7可知，準(zhǔn)一級動力學(xué)和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型R2分別為0.9515 和0.990，準(zhǔn)二級動力學(xué)模型得到的平衡吸附量為344.83 mg·g-1，與實(shí)驗(yàn)所得的飽和吸附量324.94 mg·g-1比較接近，表明準(zhǔn)二級動力學(xué)吸附模型可以更好地描述枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附行為。

表3 枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附動力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic constants of uranium adsorption by Bacillus subtilis

圖7 枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附動力學(xué)模型Fig.7 Kinetics model of uranium adsorption by Bacillus subtilis

2.7 P 的釋放

枯草芽孢桿菌在有鈾和無鈾條件下釋放到溶液中P 的濃度與時間關(guān)系如圖8所示。由圖8可以看出，在無鈾的溶液中48 h 后，枯草芽孢桿菌釋放到溶液中的磷濃度為0.02 mg·L-1，而在50 mg·L-1的鈾溶液中2 h 后，溶液中P 濃度從0 增加至0.12 mg·L-1，48 h 時，P 濃度增加至0.40 mg·L-1。這一現(xiàn)象與Jiang等[7]和Salome等[17]的研究結(jié)果相似。推測枯草芽孢桿菌在此條件下細(xì)胞受到了嚴(yán)重的脅迫，伴隨體內(nèi)自由基增加，代謝活動增強(qiáng)，促使ATP水解，壁膜破壞，磷脂分解的生理生化響應(yīng)過程中，大量的P 從枯草芽孢桿菌體內(nèi)釋放到溶液中。然而 溶液中的U(Ⅵ)并未與釋放到溶液中的P 直接作用，解吸過程證明大部分的鈾是被吸附到枯草芽孢桿菌體內(nèi)，而后面的SEM-EDS 結(jié)果表明吸附在菌體上的鈾并未與無機(jī)P 結(jié)合生成U-P 晶體。

圖8 枯草芽孢桿菌在有鈾和無鈾條件下釋放到溶液中P 的濃度與時間的關(guān)系Fig.8 Time-dependence of P released from Bacillus subtilis in U-added exposure solution and in U-free solution

2.8 掃描電子顯微鏡(SEM)

枯草芽孢桿菌與50 mg·L-1鈾溶液作用不同時間后的掃描電鏡結(jié)果如圖9所示。

由圖9（a）可以看出，枯草芽孢桿菌在吸附前細(xì)胞處于飽滿狀態(tài)，細(xì)胞表面光滑，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，與鈾作用后[圖9（b）、（c）]，細(xì)胞之間相互粘連并發(fā)生皺縮，菌體基本斷裂呈短節(jié)狀，菌體表面出現(xiàn)明顯團(tuán)狀聚集物，EDS 結(jié)果表明團(tuán)狀聚集物和枯草芽孢桿菌表面均出現(xiàn)明顯的U 峰，未見P 的峰。尖銳的Si 可能是菌體底部的蓋玻片。與對照相比，同時出現(xiàn)明顯的N 峰。文獻(xiàn)[6-7,17,19]報(bào)道的酵母菌與鈾作用過程中在菌體表面產(chǎn)生納米U-P 結(jié)晶礦化體，本研究表明枯草芽孢桿菌與鈾作用機(jī)制與酵母菌明顯不同。

2.9 紅外光譜(FTIR)

圖9 枯草芽孢桿菌對鈾吸附前后SEM 圖Fig.9 SEM images of Bacillus subtilis before（a）and after 24 h（b）and 48 h（c）adsorption uranium

圖10為枯草芽孢桿菌與初始濃度為 200 mg·L-1U(Ⅵ)，pH=5 的鈾溶液作用前后FTIR 譜圖。其中，3433.97 cm-1左右存在一個強(qiáng)而寬的譜帶，該處為羥基O—H 對應(yīng)的伸縮振動吸收峰，2927.43 cm-1是C—H 伸縮振動吸收峰；1630.10 cm-1和1404.71 cm-1附近分別歸屬為酰胺Ⅰ帶特征吸收峰和蛋白質(zhì)分子肽鍵中的C—N 鍵的伸縮振動峰，1048.65 cm-1附近的吸收峰主要來自于纖維素糖鏈和半纖維素中C—C、C—O 和C—O—C 鍵的吸收峰[4,22]。613.65 cm-1和538.65 cm-1均為PO43-的面外彎曲振動峰。由此可以推斷，枯草芽孢桿菌體內(nèi)含有較多蛋白質(zhì)、酰胺化合物和纖維素，主要有氨基、羥基、羧基、磷酸基等活性基團(tuán)。從枯草芽孢桿菌與U(Ⅵ)作用后的FTIR 光譜圖可以看出，O—H 和C—H 伸縮振動峰基本未變，酰胺Ⅰ帶特征吸收峰和C—N 鍵的伸縮振動峰在與U(Ⅵ)作用后分別向左和右移動了6 cm-1和20 cm-1，PO43-在與U(Ⅵ)作用后向左移動了75 cm-1，峰強(qiáng)明顯減弱，表明氨基、磷酸基參與了枯草芽孢桿菌對U(Ⅵ)的吸附?？莶菅挎邨U菌與鈾作用后，在2973.16 cm-1出現(xiàn)了不對稱甲基振動吸收峰，在905.31 cm-1出現(xiàn)了UO22+的反對稱伸縮振動吸收特征峰[23]。

3 結(jié) 論

圖10 枯草芽孢桿菌吸附鈾前后的紅外光譜圖Fig.10 FTIR spectra of Bacillus subtilis before and after uranium adsorption

在初始鈾濃度為50 mg·L-1，pH0=5.0，0.06 mg（DW）活體枯草芽孢桿菌在初始階段對鈾吸附較快，在2 h 時的鈾的去除率達(dá)85.07%，主要通過靜電吸引和表面絡(luò)合吸附在菌體，解吸率為52.13%。隨著時間延長至48 h，吸附率和吸附量緩慢增加至89.95%和324.94 mg·g-1，解吸率下降至36.25%，部分鈾進(jìn)入到菌體內(nèi)，同時大量磷從菌體內(nèi)釋放出來，溶液中P 的濃度達(dá)到0.4 mg·L-1?？莶菅挎邨U菌對 U(Ⅵ)的吸附更符合 Langmuir 等溫模型和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程，吸附過程是吸熱、自發(fā)進(jìn)行的，隨著反應(yīng)的發(fā)生系統(tǒng)混亂度增加。SEM-EDS 結(jié)果表明U 出現(xiàn)在菌體表面和周圍，部分以無規(guī)則形狀的團(tuán)聚物形式存在，菌體內(nèi)部斷裂呈短節(jié)狀。FTIR 表明菌體表面氨基、磷酸基參與了鈾的吸附，吸附后出現(xiàn)明顯的UO22+特征峰。

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