張夢濤，鄭 溪，曹 飛，袁守軍，2*

（1．合肥工業(yè)大學(xué)土木與水利工程學(xué)院，安徽合肥 230009;2．南京大學(xué)污染控制與資源化國家重點實驗室，江蘇南京 210046）

天然甾體雌激素是人及哺乳動物排泄的內(nèi)源雌激素，主要包括雌酮（Estrone，E1）、17α-雌二醇（17α-estradiol，17α-E2）、17β-雌二醇（17β-estradiol，17β-E2）和雌三醇（Estriol，E3）［1］。水體環(huán)境中，ng/L級的雌激素即表現(xiàn)出較強的環(huán)境風(fēng)險，如導(dǎo)致雄魚的雌化［2－4］。畜禽糞便是環(huán)境中天然甾體雌激素的重要來源之一［5－6］，而根據(jù) Lange 等［7－8］的統(tǒng)計資料，禽畜糞便中雌激素的含量又以奶牛場廢棄物中所占比例最大。近年來，隨著人們對乳肉制品需求量的增加，全國奶牛養(yǎng)殖業(yè)有了長足發(fā)展。據(jù)《2011年中國奶業(yè)統(tǒng)計摘要》統(tǒng)計，2009年安徽省內(nèi)奶牛存欄量達6．83萬頭。而目前，除了少量大型養(yǎng)殖場外，安徽省內(nèi)奶牛養(yǎng)殖場中幾乎無標(biāo)準(zhǔn)的污水處理系統(tǒng)和沼氣利用系統(tǒng);奶牛糞便的處置方式大多為收集后倒至空曠地，經(jīng)堆放后作為肥料使用。

安徽省含長江和淮河兩大重要水系，其中長江水系安徽段還包括我國第五大淡水湖巢湖。在沿江、沿湖地帶，露天堆置的牛糞受雨水沖刷，極易造成對地表水體的污染［9］，同時也可能通過滲流等作用污染地下水［10－12］。而目前，關(guān)于安徽省奶牛養(yǎng)殖廢棄物中甾體雌激素的污染現(xiàn)狀尚不清楚;開展相關(guān)的調(diào)查工作，闡明奶牛糞便中雌激素的含量特征，可為安徽省奶牛養(yǎng)殖場的科學(xué)管理及甾體雌激素的有效去除提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑 氣相色譜質(zhì)譜儀（QP2010S型，日本島津，帶AOC-20i自動進樣器）;恒溫振蕩器（THZ-82型，常州市國華電器有限公司）;臺式高速冷凍離心機（5810R型，德國Eppendorf公司）;保溫箱（AS2200，平湖美嘉保溫容器有限公司）;冷凍干燥機（Bench Top 2K型，美國VirTis公司）;旋渦混合器（QL-861型，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）;循環(huán)水式多用真空泵（SHB-ⅢG型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;超聲波清洗器（KQ-100E，昆山市超聲儀器有限公司）;氮吹儀（HSC-12A型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）;固相萃取儀（Visiprep DL，美國Supelco公司）;玻璃纖維濾膜（GF/F，?47 mm，美國 Whatman 公司）;固相萃?。⊿EP）柱（ENVI-18，6 ml，500 mg，美 國 Supelco 公 司）;dSPE 柱（Mg2SO4150 mg，PSA 50 mg，2 ml，上海安譜公司）。

E1、17β-E2-d3、17α-E2 和 17β-E2（純度均 ＞98%）購自于美國Sigma-Aldrich公司，E3（USP）購自aladdin公司，N，O-雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（BSTFA，99%）購自美國REGIS公司，乙腈（GC級）、甲醇（GC級）、乙酸乙酯（GC級）和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）均購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司，丙酮（HPLC級）購自美國Tedia試劑公司，乙醚（AR）購自上海試一化學(xué)試劑有限公司。

1．2 樣品采集 牛糞樣品采自安徽省6個典型的集中式奶牛養(yǎng)殖場（圖1），各奶牛養(yǎng)殖場基本信息如表1所示。采樣過程中，分別采集青年期（12～24月）、干奶期（產(chǎn)犢前的2個月）和泌乳期［13］（從產(chǎn)犢開始直至停止產(chǎn)奶，一般10個月左右）的奶牛糞便;為保證所取樣品具有代表性，每個樣品采集時，在畜棚內(nèi)隨機選取6個采樣點，在每個采樣點采集約500 g新鮮牛糞，然后充分混合，加入2 mol/L的H2SO425 ml進行酸化處理后，放入保溫盒中，于24 h內(nèi)進行后續(xù)處理、分析樣品中雌激素的含量。

為了評估規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場對養(yǎng)殖場附近環(huán)境的影響，在b養(yǎng)殖場牛糞堆積場附近分別采集土樣（地面以下5～10 cm）及地表水樣。土樣采集方法同牛糞樣品;水樣采集時，在水面以下約0．5 m處隨機選擇3個采樣點，每點采集1 L樣品，用5 ml 2 mol/L的H2SO4溶液酸化，至實驗室后進行混合。所有樣品采集后均放入保溫箱，并盡快運至實驗室，在24 h內(nèi)進行后續(xù)處理、分析樣品中雌激素的含量。

表1 各采樣點詳情

1．3 樣品前處理

1．3．1 固體樣品前處理。將奶牛糞便及土樣放入冷凍干燥機，凍干后研碎。稱取0．50 g置于50 ml具塞離心管中，加入10 ml去離子水，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH=2，渦旋混合1 min，然后加入10 ml乙醚，加蓋振蕩20 min，在10 000 r/min條件下離心5 min，重復(fù)以上操作3次。將提取液轉(zhuǎn)移至50 ml血清瓶中，用輕柔氮氣吹干，然后采用1 ml乙腈溶解，并轉(zhuǎn)移至1．5 ml的dSPE柱中手動振蕩4 min，10 000 r/min離心3 min后，取0．6 ml上清液至GC樣品瓶中，以輕柔氮氣吹干，待衍生化處理。

1．3．2 水樣前處理。取500 ml水樣，采用玻璃纖維膜過濾以去除懸浮雜質(zhì)，然后用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH=2．0，以15 ml/min的流速通過SPE柱（SPE柱在使用前分別用3 ml的乙酸乙酯/丙酮溶液（V∶V=1∶1）、3 ml的甲醇和 3 ml pH=2的水活化）。用5 ml的甲醇/水（V∶V=4∶6）清洗SPE 柱，真空干燥1 h，最終以8 ml乙酸乙酯/丙酮（V∶V=1∶1）洗脫樣品。洗脫液以輕柔氮氣吹干，然后采用1 ml乙腈定容，并轉(zhuǎn)移至GC樣品瓶中，以輕柔氮氣吹干，待衍生化處理。

1．4 衍生化 采用硅烷化試劑BSTFA作為衍生化試劑。向待衍生化樣品中加入0．100 ml BSTFA，然后加入0．400 ml DMF，加蓋密封，在室溫條件下反應(yīng)24 h，然后采用GC－MS測定樣品中的雌激素濃度。

1．5 氣相色譜－質(zhì)譜條件 色譜柱為SHRX-5MS毛細(xì)管柱（0．25 μm ×0．25 μm ×30 m，美國 J＆W 科技公司）;柱溫采用一階升溫程序控制:起始柱溫為80℃，并保持1 min，然后以20℃/min的速度使最終柱溫達到310℃，并保持6 min;載氣為高純氦氣，載氣線速度為30．0 cm/s，采用分流進樣，分流比為1，進樣口溫度為260℃;電離源為離子源，電子能量為70 eV，離子源溫度為220℃，傳輸線溫度為250℃，溶劑延遲時間為3 min。利用全范圍掃描（Scan）和選擇性離子模式（Selected Ion Monitoring，SIM）來進行質(zhì)譜分析。根據(jù)Scan譜圖掃描的結(jié)果（m/z為50～510），確定各化合物的特征離子。對于17α-E2和17β-E2衍生化后的產(chǎn)物，質(zhì)荷比m/z=416;對于E1衍生化后的產(chǎn)物，質(zhì)荷比m/z=342;對于E3衍生化后的產(chǎn)物，質(zhì)荷比m/z=504;對于17β-E2-d3衍生化后的產(chǎn)物，質(zhì)荷比m/z=419。雌激素的衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜圖如圖2所示。

1．6 方法有效性驗證 對糞便樣品和水樣進行梯度加標(biāo)試驗，糞便樣品加標(biāo)量分別為100、400和1 600 μg/kg，水樣加標(biāo)量分別為100、400和1 000 ng/L。方法重現(xiàn)性通過加標(biāo)回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來評估（n=3～6）。各加標(biāo)水平下，固體樣品的RSD為4．5% ～25．9%，液體樣品的RSD為3．2% ～21．9%。檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為3倍和10倍信噪比對應(yīng)的濃度。在10～2 000 μg/kg（對應(yīng)水樣的濃度為10～2 000 ng/L）濃度范圍內(nèi)，設(shè)備線性良好。相關(guān)方法有效性驗證參數(shù)如表2所示。

2 結(jié)果與分析

表2 方法有效性驗證參數(shù)

2．1 甾體雌激素含量特征 分別對6個奶牛養(yǎng)殖場中青年期、干奶期和泌乳期奶牛糞便中甾體雌激素含量進行測定分析，結(jié)果如圖3所示。與Hanselman等［14］的研究結(jié)果一致，奶牛糞便均監(jiān)測到E1、17α-E2和17β-E2。除了在養(yǎng)殖場a的青年期奶牛和養(yǎng)殖場e的干奶期奶牛和泌乳期奶牛樣品中檢測到E3外，其余樣品均未檢測到E3。E3主要分布于奶牛的尿液中［15］，所以養(yǎng)殖場a和e中測得的E3可能是由于牛糞樣品中混入尿液引起的。

處于不同生理階段的奶牛的雌激素排泄量存在顯著性差異（P=0．000 14＜0．01）。青年期奶牛糞便中雌激素的濃度最低，平均為 432．90 μg/kg（RSD=20．05%）;干奶期奶牛次之，為1 114．51 μg/kg（RSD=23．88%）;泌乳期奶牛最高，為1 540．13 μg/kg（RSD=30．25%），這一結(jié)論與我國東北地區(qū)所得數(shù)據(jù)類似［16］。除養(yǎng)殖場e和f牛糞中E1所占比例較高外，各種雌激素（主要是 E1、17α-E2和17β-E2）所占比例也較為相近?？梢?，不同養(yǎng)殖場中，相同生理時期的奶牛，雌激素的排放總量和比例均較為相似。

2．2 奶牛養(yǎng)殖場雌激素的污染潛力分析 由于不同雌激素的活性不同，試驗中采用17β-E2活性當(dāng)量（EEQ）來表征樣品中總雌激素當(dāng)量濃度，如式（1）所示。

式中，EEQ為樣品中總雌激素的17β-E2當(dāng)量值，μg/kg;EEFi為不同雌激素的17β-E2活性當(dāng)量系數(shù)，其中E1、17α-E2和17β-E2 的EEFi值分別為 0．15、0．03 和 1．00［17－18］;ci為各雌激素平均濃度，μg/kg。

奶牛的最佳經(jīng)濟效益周期一般為6年［19］，其中，青年期以前（0～12個月）雌激素排放量較少，可忽略不計;12～24個月處于青年期，此后4年每年兩個月處于干奶期，10個月處于泌乳期（即4年中奶牛有0．67年處于干奶期，3．33年處于泌乳期）。安徽省奶牛存欄量為6．83萬頭，單頭奶牛日排泄糞便約4．51 kg［20］。結(jié)合上述雌激素濃度等數(shù)據(jù)，可計算出安徽省奶牛養(yǎng)殖場雌激素排泄當(dāng)量，結(jié)果如表3所示。

表3 安徽省奶牛養(yǎng)殖場奶牛糞便雌激素排泄當(dāng)量計算

由表3可知，奶牛通過糞便年平均排放的雌激素當(dāng)量為0．34 g/（頭·a），即日平均排放的雌激素當(dāng)量為931．51 μg/（頭·d）。安徽省奶牛場牛糞中雌激素年排泄當(dāng)量為23．24 kg/a。因此，若處置不當(dāng)，奶牛糞便中大量雌激素進入環(huán)境，則會對周邊水體及土壤環(huán)境造成嚴(yán)重危害。由表1可知，安徽省奶牛養(yǎng)殖場糞便大多數(shù)采用自然堆置，部分采用厭氧發(fā)酵處理;而研究表明［21－23］，厭氧工藝對雌激素的去除率低下。因此，合理的奶牛糞便管理措施及高效的雌激素處理工藝的開發(fā)顯得尤為迫切。

2．3 奶牛養(yǎng)殖場周邊環(huán)境中雌激素污染特征 奶牛養(yǎng)殖場附近地表水體和糞便堆積場土樣中雌激素濃度如圖4所示。水樣和土樣中雌激素當(dāng)量濃度分別為1 252．02 ng/L和1 424．21 μg/kg。不同于糞便樣品，在地表水樣和堆積場土壤樣品中雌激素主要為17β-E2（分別占雌激素總量的91．88%和94．23%）。而研究表明［24－25］，奶牛尿液中通常含有較高濃度雌激素17β-E2。可見，除了奶牛糞便以外，尿液中雌激素的污染潛力也不容忽視。另外，糞便及尿液中以結(jié)合態(tài)存在的雌激素對環(huán)境也存在一定污染，在微生物作用下，結(jié)合態(tài)雌激素轉(zhuǎn)化為活性更高的游離態(tài)雌激素［26－27］，并在徑流和入滲等過程進入環(huán)境，從而對周邊水體及土壤造成污染。

3 結(jié)論

通過對安徽省主要集約化奶牛養(yǎng)殖場糞便中甾體雌激素調(diào)查發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖場糞便中甾體雌激素主要以E1、17α-E2和17β-E2 3種形式存在;不同采樣點牛糞中雌激素總量和及各單一雌激素比例無明顯差異。

調(diào)查結(jié)果顯示，奶牛日排泄雌激素當(dāng)量值為931．51 μg/（頭·d），安徽省奶牛經(jīng)由糞便的年雌激素排泄當(dāng)量為23．24 kg/a。若處置不當(dāng)，奶牛養(yǎng)殖場將會對周邊水體及土壤環(huán)境造成嚴(yán)重危害。

奶牛養(yǎng)殖場附近水體和土樣中雌激素的當(dāng)量濃度分別為 1 252．02 ng/L 和 1 424．21 μg/kg。若受污染的水流入附近水系或者堆積場土樣中雌激素隨降水滲入地下水，則會對周邊環(huán)境帶來嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險。因此，對于集約化奶牛養(yǎng)殖場需要采取更為科學(xué)合理的管理方法，妥善處理及回用養(yǎng)殖場廢棄物，最大程度降低養(yǎng)殖場糞便中甾體雌激素的環(huán)境風(fēng)險。

［1］TERNES T A，KRECKEL P，MUELLER J．Behaviour and occurrence of estrogens in municipal sewage treatment plants——II．Aerobic batch experiments with activated sludge［J］．The Science of the Total Environment，1999，225（1/2）:91 －99．

［2］ORN S，HOLBECH H，MADSEN T H，et al．Gonad development and vitellogenin production in zebrafish（Danio rerio）exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone［J］．Aquatic Toxicology，2003，65（4）:397 －411．

［3］SANTOS L H，ARAJO A，F(xiàn)ACHINI A，et al．Ecotoxicological aspects related to the presence of pharmaceuticals in the aquatic environment［J］．Journal of Hazardous Materials，2010，175（1）:45 －95．

［4］張照斌，胡建英，賽思翔，等．青鳉魚ERRα的克隆、序列分析、組織表達及其對不同 EDCs暴露的響應(yīng)［J］．環(huán)境科學(xué)，2008，29（11）:3153－3158．

［5］LIU S，YING G G，ZHANG R Q，et al．Fate and occurrence of steroids in swine and dairy cattle farms with different farming scales and wastes disposal systems［J］．Environmental Pollution，2012，170:190 －201．

［6］劉姝芳，李艷霞，張雪蓮，等．東北三省畜禽養(yǎng)殖類固醇激素排放及其潛在污染風(fēng)險［J］．環(huán)境科學(xué)，2013，34（8）:3180 －3187．

［7］JOHNSON A C，WILLIAMS R J，MATTHIESSEN P．The potential steroid hormone contribution of farm animals to freshwaters，the United Kingdom as a case study［J］．Science of the Total Environment，2006，362（1/3）:166－178．

［8］LANGE I G，DAXENBERGER A，SCHIFFER B，et al．Sex hormones originating from different livestock production systems:fate and potential disrupting activity in the environment［J］．Analytica Chimica Acta，2002，473（1）:27－37．

［9］YANG Y Y，GRAY J L，F(xiàn)URLONG E T，et al．Steroid hormone runoff from agricultural test plots applied with municipal biosolids［J］．Environmental Science ＆ Technology，2012，46（5）:2746 －2754．

［10］STEINER L D，BIDWELL V J，DI H J，et al．Transport and modeling of estrogenic hormones in a dairy farm effluent through undisturbed soil lysimeters［J］．Environmental Science ＆ Technology，2010，44（7）:2341 －2347．

［11］ARNON S，DAHAN O，ELHANANY S，et al．Transport of testosterone and estrogen from dairy－farm waste lagoons to groundwater［J］．Environmental Science ＆ Technology，2008，42（15）:5521 －5526．

［12］BARTELT－HUNT S，SNOW D D，DAMON－POWELL T，et al．Occurrence of steroid hormones and antibiotics in shallow groundwater impacted by livestock waste control facilities［J］．Journal of Contaminant Hydrology，2011，123（3/4）:94 －103．

［13］NU＇?EZ－DOMíNGUEZ R，CUNDIFF L，DICKERSON G，et al．Lifetime production of beef heifers calving first at two vs three years of age［J］．Journal of Animal Science，1991，69（9）:3467 －3479．

［14］HANSELMAN T A，GRAETZ D A，WILKIE A C．Manure－borne estrogens as potential environmental contaminants:A review［J］．Environmental Science ＆ Technology，2003，37（24）:5471 －5478．

［15］ERB R E，RANDEL R D，MELLIN T N，et al．Urinary estrogen excretion rates during pregnancy in the bovine［J］．Journal of Dairy Science，1968，51（3）:416 －419．

［16］HAN W，LI Y X，YANG M，et al．Presence and determination of manureborne estrogens from dairy and beef cattle feeding operations in northeast China［J］．Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，2011，86（5）:465 －469．

［17］邵曉玲．城市水循環(huán)中環(huán)境激素的變化規(guī)律與KMnO4控制效能研究［D］．哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2009:42 －43．

［18］吳世閩，賈璦，彭輝，等．遼東灣海水中甾體雌激素的檢測及生態(tài)風(fēng)險評價［J］．中國環(huán)境科學(xué)，2011，31（11）:1904 －1909．

［19］NUNEZ－DOMINGUEZ R，CUNDIFF L V，DICKERSON G E，et al．Lifetime production of beef heifers calving first at two vs three years of age［J］．Journal of Animal Science，1991，69（9）:3467 －3479．

［20］HAYNES R J，WILLIAMS P H．Nutrient cycling and soil fertility in the grazed pasture ecosystem［J］．Advances in Agronomy，1993，49:119 －199．

［21］ZHENG W，LI X，YATES S R，et al．Anaerobic transformation kinetics and mechanism of steroid estrogenic hormones in dairy lagoon water［J］．Environmental Science ＆ Technology，2012，46（10）:5471 －5478．

［22］YANG Y Y，BORCH T，YOUNG R B，et al．Degradation kinetics of testosterone by manure－borne bacteria:Influence of temperature，pH，glucose amendments，and dissolved oxygen［J］．Journal of Environmental Quality，2010，39（4）:1153 －1160．

［23］COMBALBERT S，HERNANDEZ－RAQUET G．Occurrence，fate，and biodegradation of estrogens in sewage and manure［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2010，86（6）:1671 －1692．

［24］ZHANG H，SHI J，LIU X，et al．Occurrence and removal of free estrogens，conjugated estrogens，and bisphenol A in manure treatment facilities in East China［J］．Water research，2014，58:248 －257．

［25］ZHANG H，SHI J，LIU X，et al．Occurrence of free estrogens，conjugated estrogens，and bisphenol A in fresh livestock excreta and their removal by composting in North China［J］．Environ Sci Pollut Res，2014，21（16）:9939－9947．

［26］KUMAR V，NAKADA N，YASOJIMA M，et al．The arrival and discharge of conjugated estrogens from a range of different sewage treatment plants in the UK［J］．Chemosphere，2011，82（8）:1124 －1128．

［27］TERNES T A，STUMPF M，MUELLER J，et al．Behavior and occurrence of estrogens in municipal sewage treatment plants——I．Investigations in Germany，Canada and Brazil［J］．The Science of the Total Environment，1999，225（1/2）:81－90．