張順益+秦華偉+任鳳山+劉廷利+陳珍珍+門興元+于毅+許永玉+李麗莉

摘 要：為明確桃小食心蟲越冬適應(yīng)機(jī)制，室內(nèi)利用試劑盒測定了不同滯育時(shí)間桃小食心蟲滯育幼蟲的海藻糖酶、山梨醇脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸激酶和堿性磷酸酶的活力。結(jié)果表明，不同滯育時(shí)間桃小食心蟲體內(nèi)海藻糖酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、堿性磷酸激酶活力差異顯著，而山梨醇脫氫酶活力差異不顯著。海藻糖酶活力在滯育初期最高，而后隨著滯育時(shí)間的延長逐漸降低;己糖激酶活力在滯育初期較低，在滯育后期先迅速升高再迅速下降;丙酮酸激酶在滯育中期活力最高，而堿性磷酸激酶活力在滯育初期最高。這表明桃小食心蟲在滯育過程中通過代謝酶的調(diào)節(jié)，提高其越冬期間的抗寒能力，保證順利越冬。

關(guān)鍵詞：桃小食心蟲;越冬;滯育;代謝酶

中圖分類號：S436.621.2+9 ?文獻(xiàn)標(biāo)識號：A ?文章編號：1001-4942（2015）06-0097-04

Activity Changes of Five Metabolic Enzymes in

Carposina sasakii Matsumura during Diapause

Zhang Shunyi1，2， Qin Huawei2， Ren Fengshan2， Liu Tingli2，

Chen Zhenzhen1， Men Xingyuan2， Yu Yi2， Xu Yongyu1*， Li Lili2*

（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China;2. Institute of Plant Protection，

Shandong Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory for Plant Virology of Shandong， Jinan 250100， China）

Abstract To clarify the physiological adaptation mechanisms of overwintering， the activities of 5 metabolic enzymes， including trehalase， sorbitol dehydrogenase， hexokinase， pyruvate kinase and alkaline phosphatase， of diapause larvae of Carposina sasakii Matsumura during ?different diapause time were measured in laboratory by kit. The results showed that the activities of trehalase， hexokinase， pyruvate kinase， alkaline phosphatase had significant differences between different diapause time， while those of sorbitol dehydrogenase had no significant difference. The trehalase activity was the highest in early diapause， then gradually decreased with the prolongation of diapauses duration. The hexokinase activity was lower in early diapause， then increased rapidly and decreased rapidly in later diapause. The pyruvate kinase activity reached the highest level in mid-diapause. The highest activity of alkaline phosphatase appeared in early diapause. These indicated that Carposina sasakii Matsumura improved their cold tolerance by regulating metabolic enzymes during diapause to ensure overwintering smoothly.

Key words Carposina sasakii; Overwintering; Diapause; Metabolic enzyme

昆蟲屬于變溫動(dòng)物，其體溫隨著環(huán)境溫度的變化而進(jìn)行相應(yīng)的變化。低溫是影響昆蟲越冬的重要環(huán)境因素。在長期的適應(yīng)性進(jìn)化中，昆蟲獲得了一系列的耐寒策略：越冬前期積累糖原和脂肪，越冬期主要積累海藻糖、葡萄糖、甘油、山梨醇和脂肪等抗凍保護(hù)劑?？箖霰Ｗo(hù)劑有穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、保護(hù)蛋白的功能，并能通過溶質(zhì)效應(yīng)降低昆蟲體內(nèi)過冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)，從而提高昆蟲抗寒能力，使昆蟲度過嚴(yán)寒的冬季[1，2]。這些抗凍保護(hù)性物質(zhì)則是昆蟲在低溫條件下，通過誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)體內(nèi)一系列中間代謝酶來合成的[3]。因此了解越冬過程中參與抗凍保護(hù)性物質(zhì)合成的中間代謝酶活性的變化，對于進(jìn)一步闡明越冬幼蟲的生理生化機(jī)制具有重要作用。

桃小食心蟲（Carposina sasakii Matsumura）屬于鱗翅目（Lepidoptera）蛀果蛾科（Carposinidae），是我國北方果樹生產(chǎn)中危害最大、發(fā)生面積最普遍的食心蟲類害蟲[4]。桃小食心蟲以老熟幼蟲滯育越冬，在滯育期間生長發(fā)育幾乎處于停滯狀態(tài)，但是體內(nèi)仍然進(jìn)行著一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)[5]。目前關(guān)于桃小食心蟲滯育期間生理生化的研究主要集中在滯育期間蛋白、總糖、糖原、海藻糖、甘油、山梨醇和脂肪等抗凍性保護(hù)劑的變化上[2，5，6]，但這些物質(zhì)變化的機(jī)理不明，參與抗凍保護(hù)性物質(zhì)合成的中間代謝酶的研究未見報(bào)道。因此本研究選取了昆蟲滯育期間起關(guān)鍵作用的海藻糖酶（trehalase）、山梨醇脫氫酶（sorbitol dehydrogenase）、己糖激酶（hexokinase）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）5種中間代謝酶進(jìn)行活力測定，以期為更深入研究桃小食心蟲越冬機(jī)制奠定基礎(chǔ)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

試蟲為2013年10月采自山東省青州和萊蕪的山楂自然脫果的桃小食心蟲老熟幼蟲，帶回實(shí)驗(yàn)室后放入消毒的沙子中自然做繭，挑取健康蟲繭放入盛有鋸末（濕度為12%）的花盆中（鋸末、花盆經(jīng)過高溫干燥鼓風(fēng)烘箱120℃滅菌24 h），花盆表層用保鮮膜覆蓋并封好，放置于4℃恒溫冰箱中保存待用。從冷藏第20 d開始取樣，之后每隔20 d取一次樣，每次取出40～50頭健康蟲繭置于-20℃冰箱中冷凍待用，共取樣7次。

1.2 方法

1.2.1 酶液的提取 海藻糖酶、山梨醇脫氫酶和堿性磷酸酶的提取方法相同：取桃小食心蟲試蟲4～6只，放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入2 mL提取液，冰水浴中充分勻漿后在4℃條件下2 500 r/min離心10 min，所得上清液即為酶液。每處理重復(fù)3次。

己糖激酶和丙酮酸激酶的提取方法相同：取桃小食心蟲試蟲4～6只，準(zhǔn)確稱重后放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，按質(zhì)量體積比1∶9的比例加入0.9%的生理鹽水，冰水浴中充分勻漿后在4℃條件下2 500 r/min離心10 min，所得上清液即為酶液。每處理重復(fù)3次。

1.2.2 酶蛋白濃度的測定 使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行可溶性蛋白質(zhì)濃度的測定，具體方法參見天根生化科技（北京）有限公司的試劑盒說明書。

1.2.3 酶活性的測定及計(jì)算 5種酶活性的測定及計(jì)算均根據(jù)南京建成生物技術(shù)研究所的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用軟件SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析。試驗(yàn)所獲數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，采用Tukey法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。用Microsoft Excel 2010繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻糖酶的活力變化

由圖1可以看出，桃小食心蟲老熟幼蟲體內(nèi)海藻糖酶的活力在滯育20 d時(shí)達(dá)最高值36.19 U/g prot.，且隨著滯育時(shí)間的延長呈顯著下降趨勢（F=109.94， P<0.05）;滯育60 d時(shí)海藻糖酶活力為25.82 U/g prot.，為滯育20 d時(shí)海藻糖酶活力的71.35%;滯育80 d后的海藻糖酶活力一直維持在較低水平。

注：圖中各數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母

表示在0.05水平下差異顯著，下同。

圖1 4℃條件下滯育的桃小食心蟲

幼蟲體內(nèi)海藻糖酶活力變化

2.2 山梨醇脫氫酶的活力變化

圖2結(jié)果顯示，桃小食心蟲老熟幼蟲體內(nèi)山梨醇脫氫酶活力在滯育80 d時(shí)達(dá)最高值19.61 U/g prot.，較滯育20 d時(shí)15.41 U/g prot.，增加27.26%。整個(gè)滯育期間，山梨醇脫氫酶活力維持在15.41～19.68 U/g prot.，雖有波動(dòng)但處理間差異不顯著（F=2.57，P>0.05）。

圖2 4℃條件下滯育桃小食心蟲幼蟲

體內(nèi)山梨醇脫氫酶活力變化

2.3 己糖激酶的活力變化

圖3結(jié)果顯示，桃小食心蟲老熟幼蟲體內(nèi)己糖激酶活力在滯育80 d以前維持在較低水平，而后呈顯著上升趨勢（F=63.27， P<0.05），滯育120 d時(shí)達(dá)最高值43.60 U/g prot.，較滯育20 d時(shí)的11.62 U/g prot.增加2.75倍。隨著滯育時(shí)間延長己糖激酶活力顯著下降（P<0.05），滯育140 d時(shí)降至12.57 U/g prot.，較滯育120 d時(shí)下降71.17%。

圖3 4℃條件下滯育的桃小食心蟲幼蟲

體內(nèi)己糖激酶活力變化

2.4 丙酮酸激酶的活力變化

圖4結(jié)果顯示，桃小食心蟲老熟幼蟲體內(nèi)丙酮酸激酶活力滯育初期呈顯著上升趨勢（F=29.91， P<0.05），滯育60 d時(shí)達(dá)最高值33.24 U/g prot.，較滯育20 d的14.58 U/g prot.增加1.28倍。隨著滯育時(shí)間延長，丙酮酸激酶活力呈下降趨勢，滯育120 d時(shí)降至14.94 U/g prot.，隨后有小幅回升。

圖4 4℃條件下滯育桃小食心蟲幼蟲

體內(nèi)丙酮酸激酶活力變化

2.5 堿性磷酸酶的活力變化

圖5結(jié)果顯示，桃小食心蟲老熟幼蟲體內(nèi)堿性磷酸酶活力在滯育20 d時(shí)達(dá)最高值242.62 U/L，且隨著滯育時(shí)間的延長呈顯著下降趨勢（F=196.05， P<0.05），滯育60 d時(shí)降至最低值43.19 U/L，然后一直維持在較低的水平。

圖5 4℃條件下滯育桃小食心蟲

幼蟲體內(nèi)堿性磷酸酶活力變化

3 討論與結(jié)論

3.1 海藻糖酶的活力變化

海藻糖不僅是昆蟲生長發(fā)育必須的能量物質(zhì)，而且是低溫條件下保護(hù)昆蟲生命過程和生物特征的抗凍保護(hù)劑[7，8]。海藻糖酶是一種催化海藻糖水解的酶，可以將1分子的海藻糖水解成2分子的葡萄糖[9，10]。本試驗(yàn)中桃小食心蟲滯育幼蟲體內(nèi)海藻糖酶活力隨處理時(shí)間的延長逐漸下降，從而使海藻糖含量在滯育過程中維持在較高水平，提高桃小食心蟲抗逆能力，促使其順利越冬，這與麥紅吸漿蟲、梨小食心蟲、家蠶的海藻糖酶活性變化相一致[11～13]。且該結(jié)果與丁惠梅[2]的試驗(yàn)結(jié)果相吻合，桃小食心蟲在滯育過程中通過積累海藻糖提高抗逆能力。

3.2 山梨醇脫氫酶的活力變化

近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，山梨醇脫氫酶在昆蟲滯育以及滯育解除過程中均起著重要作用。在昆蟲滯育期間，山梨醇能夠保護(hù)昆蟲免受低溫凍傷[14]，因此昆蟲滯育解除時(shí)，山梨醇脫氫酶必不可少，并且含量有所上升[15]。本試驗(yàn)中，山梨醇脫氫酶活力變化總體比較平穩(wěn)，一直維持在較低水平，說明桃小食心蟲在滯育期間積累山梨醇。endprint

3.3 己糖激酶和丙酮酸激酶的活力變化

己糖激酶和丙酮酸激酶都是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，其中己糖激酶是一個(gè)由單糖（六碳糖）進(jìn)入糖酵解途徑的酶，也是越冬后期海藻糖的分解產(chǎn)物——葡萄糖轉(zhuǎn)化為其它代謝能源的一個(gè)關(guān)鍵酶[3]，丙酮酸激酶能催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸[16]。桃小食心蟲在滯育初期，己糖激酶的活力較低，說明己糖的酵解較少;丙酮酸激酶含量逐漸升高，說明糖原酵解正在加強(qiáng)，桃小食心蟲在滯育期間不積累糖原，這與王鵬等[5]的研究結(jié)果一致。桃小食心蟲在滯育80～120 d時(shí)己糖激酶的活力迅速升高，說明此時(shí)桃小食心蟲通過酵解單糖為其生命活動(dòng)提供能量;丙酮酸激酶的活力迅速下降，說明此時(shí)糖原的酵解正在減弱。而后己糖激酶和丙酮酸激酶的活力降低，說明糖酵解減弱，生命活動(dòng)維持在較低水平，從而提高其耐寒性。

3.4 堿性磷酸酶的活力變化

堿性磷酸酶是一類非特異性磷酸水解酶，能催化磷酸單酯的水解及磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，是生物代謝過程中重要的調(diào)控酶[17]。堿性磷酸酶對昆蟲滯育時(shí)間有一定的調(diào)控作用[18]。酶活力的穩(wěn)定性對于生物代謝的穩(wěn)定性至關(guān)重要，酶活力越穩(wěn)定，生物代謝就越穩(wěn)定，生物適應(yīng)能力就越強(qiáng)[19]。本試驗(yàn)中桃小食心蟲體內(nèi)堿性磷酸酶活性在滯育20～60 d時(shí)迅速下降，而后在較低水平上下波動(dòng)，說明桃小食心蟲在滯育過程中代謝活動(dòng)逐漸減弱，然后維持在較低水平，從而降低體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消耗，使桃小食心蟲順利度過嚴(yán)寒的冬季，這與何超等[12]的研究結(jié)果相似。

試驗(yàn)結(jié)果表明桃小食心蟲滯育期間體內(nèi)依然進(jìn)行著一系列復(fù)雜的代謝，與桃小食心蟲滯育有關(guān)的代謝酶（海藻糖酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、堿性磷酸酶）活力發(fā)生了顯著變化。桃小食心蟲通過對相關(guān)酶類的調(diào)控，使其在越冬期間體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝得到調(diào)節(jié)，提高了桃小食心蟲抵御外界不良環(huán)境條件的能力，從而順利越冬。

參 考 文 獻(xiàn)：

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