薛麗麗 閆冰 李一

1.廈門大學附屬第一醫(yī)院口腔科；2.耳鼻喉頭頸外科，廈門 361003；3.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科（四川大學），成都 610041

隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是交叉學科的興起和發(fā)展，光譜學被越來越多地應用在醫(yī)學研究中。光譜學主要是通過分析樣本的反射光和吸收光之間的改變而研究被測樣本的一門學科。在醫(yī)學研究中，光譜學主要涉及紅外光譜、熒光光譜和拉曼光譜[1]。相對于前兩者而言，拉曼光譜具有光譜信息豐富，對樣本無需特殊處理和受組織內(nèi)水分影響小等優(yōu)點，近年來成為臨床原位診斷技術(shù)的研究熱點[2]。本文通過復習文獻，對拉曼光譜在口腔醫(yī)學中的應用作一綜述。

1 拉曼光譜的原理

拉曼散射是由印度科學家拉曼于1928年發(fā)現(xiàn)[3]。從量子力學的角度解釋，拉曼散射是指一部分光射向物體后發(fā)生的非彈性散射，其光子的能量被物體分子中處于基態(tài)的電子獲取使得電子躍遷至一個虛態(tài)，處于虛態(tài)的電子不穩(wěn)定，有向外釋放能量回到穩(wěn)態(tài)的趨勢，向外釋放的能量以光子的形態(tài)釋放出來，釋放出這部分光的波長與入射光不同，稱作拉曼散射[1,3]。

拉曼圖譜是將拉曼散射中散射光和入射光之間的頻率改變轉(zhuǎn)化為圖譜形式，通常將拉曼散射的強度相對波長的函數(shù)圖稱為拉曼光譜。在拉曼圖譜中，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類和核酸等生物大分子都有其對應的頻移譜帶，通過分析這些譜帶的變化就可以獲取這些生物大分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，因此拉曼光譜又被稱為“分子指紋”[4]。

隨著儀器設備的不斷發(fā)展，拉曼光譜技術(shù)也發(fā)展為顯微拉曼光譜技術(shù)、共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)、表面增強拉曼光譜技術(shù)等。顯微拉曼光譜技術(shù)是將顯微技術(shù)與拉曼光譜結(jié)合，可以檢測如單個細胞等微小樣本；共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)則是結(jié)合激光共聚焦原理能夠更加精確地檢測樣本的拉曼信號；表面增強拉曼光譜技術(shù)則是借助貴金屬表面特有的拉曼增強效應可以指數(shù)級地增強拉曼信號強度。隨著拉曼光譜技術(shù)的發(fā)展，從對組織標本的研究到單個細胞的檢測[5-6]，從對病變組織的檢測到臨床疾病診斷模型的建立[7-8]，從癌癥組織檢測到體液標本的鑒定[9-10]，拉曼光譜技術(shù)已被廣泛應用于醫(yī)學研究領域，具有巨大的應用潛力。

2 拉曼光譜在口腔醫(yī)學不同學科中的應用

2.1 拉曼光譜在口腔內(nèi)科學中的應用

Guze等[11]利用光導纖維探頭獲得51個健康志愿者（25個高加索人和26個亞洲人）口腔內(nèi)不同部位正常黏膜的拉曼光譜。他們使用785 nm、30 mW的近紅外激光在不同部位的口腔黏膜處照射1 s，獲得正常黏膜的拉曼光譜，結(jié)果顯示：口腔正常黏膜在1 665 cm-1附近有較強的峰值，其對應的是蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ；而在2 900 cm-1處的峰值則表示是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)相關分子鍵的振動。該研究表明不同部位黏膜的拉曼光譜不同，主要跟黏膜的角化程度有關，而與年齡和性別無關。這項研究為拉曼光譜應用于口腔黏膜疾病的臨床原位無創(chuàng)診斷打下基礎。

Zenone等[12]通過對新鮮的口腔天皰瘡黏膜標本和正常黏膜標本的顯微拉曼光譜研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常黏膜，天皰瘡病變黏膜在644、1 234、1 423、1 657 cm-1處發(fā)生明顯改變，可以很好地鑒別天皰瘡黏膜組織和正常黏膜組織，具有高度靈敏性。進一步研究[13]發(fā)現(xiàn)，天皰瘡患者和正常人血漿的拉曼光譜也存在差異；由于血漿獲取方便，可以借助拉曼光譜對天皰瘡等口腔黏膜疾病進行鑒別診斷[13]。

舍格倫綜合征是一種自身免疫性疾病，其特征表現(xiàn)為外分泌腺如淚腺、唾液腺的進行性破壞，導致眼干、口干為主要臨床表現(xiàn)的病征。舍格倫綜合征的臨床診斷主要依據(jù)唇腺活檢。薛麗麗等[14]通過對正常唇腺及病變唇腺的拉曼光譜進行分析，確定了舍格倫綜合征病變唇腺光譜的診斷價值，并通過化學計量學建立診斷模型，可以很好地鑒別病變唇腺及正常唇腺，為拉曼光譜技術(shù)在舍格倫綜合征病變唇腺的檢測提供了可能。

在對牙齒礦化組織進行的拉曼光譜研究中發(fā)現(xiàn)，在959 cm-1處有一個強峰值，其位置表示的是磷酸根的振動，此峰值強度從釉質(zhì)、釉牙本質(zhì)界到牙本質(zhì)逐漸減弱，按組織學上無機礦物質(zhì)從釉質(zhì)到牙本質(zhì)逐漸減少來分析，說明其峰值強度與磷酸鹽含量有關[15]。Ko等[16]在研究釉質(zhì)拉曼光譜時發(fā)現(xiàn)，釉質(zhì)光譜具有較強的偏振各向異性，而發(fā)生齲壞的釉質(zhì)的偏振各向異性較弱。正常釉質(zhì)在959 cm-1有較強的峰值，表示的是磷酸鹽的含量較高，而齲壞釉質(zhì)在959 cm-1峰值較正常釉質(zhì)弱，提示釉質(zhì)脫礦導致其磷酸鹽含量減少。Ko等[17]通過改進拉曼光譜系統(tǒng)，利用光導纖維收集釉質(zhì)的拉曼光譜，取得了良好的效果，顯示了拉曼光譜診斷早期齲壞的潛力。

在牙周炎診斷方面，拉曼光譜技術(shù)也表現(xiàn)出巨大的潛力。Gonchukov等[18]對風干的唾液進行研究時發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜可以很好地檢測出一些唾液中大分子生物標志物，牙周炎患者唾液光譜中波數(shù)1 155、1 525、1 033和1 611 cm-1對應的生物標志物與正常對照組唾液有所不同，提示牙周炎患者唾液中類胡蘿卜素、糖蛋白、黏蛋白基質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生改變，可作為鑒別診斷依據(jù)將牙周炎患者與正常人群區(qū)分。

2.2 拉曼光譜在口腔材料學及修復科學中的應用

隨著科學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新型醫(yī)用材料被應用到口腔科學的臨床治療當中，拉曼光譜為這些材料的研究提供了一種新方法。Gauthier等[19]通過分析拉曼光譜中二甲基丙烯酸單體中C=C雙鍵的強度來檢測樹脂的固化程度，結(jié)果表明：應用拉曼光譜檢測樹脂固化程度的準確性與傳統(tǒng)方法一致，為檢測樹脂固化程度提供了新的便捷方法。Khalil等[20]和Cassoni等[21]分別應用拉曼光譜對牙科復合樹脂的聚合程度進行評價，均獲得了滿意的效果。復合樹脂粘接劑是通過滲透到經(jīng)酸蝕脫礦的牙本質(zhì)表面起到粘接作用的，應用拉曼光譜和掃描電子顯微鏡技術(shù)，對比研究一步酸蝕法處理后樹脂滲透進牙本質(zhì)的程度，發(fā)現(xiàn)拉曼光譜可以準確地反應樹脂滲透的部位，對滲透深度的檢測較掃描電子顯微鏡更加準確[22]。Lopes等[23]在研究激光對種植體周圍成骨性的生物調(diào)節(jié)作用時發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜可以簡單準確地評價種植體周圍的成骨量和骨質(zhì)量，這為種植體周圍骨愈合研究提供了一種新技術(shù)。

2.3 拉曼光譜在口腔頜面外科學中的應用

口腔癌的發(fā)病率和死亡率在頭頸部惡性腫瘤中均比較高，能否早期診斷是決定預后的關鍵[24]。Oliveira等[24]和Malini等[25]通過對口腔黏膜組織切片的拉曼光譜進行研究發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜能夠鑒別正常組織、炎癥組織、癌前病變和癌變組織。正常黏膜組織在1 750 cm-1處C=C和1 650 cm-1處C=O鍵的峰值弱且譜峰尖銳，1 080 cm-1處譜峰寬大，表明磷酸磷脂含量較高；而癌變組織在1 650、1450 cm-1處及1 200～1 350 cm-1處譜峰值強且譜帶寬大，這些分別表示酰胺Ⅰ、CH2和酰胺Ⅲ，說明癌變組織中蛋白質(zhì)含量明顯升高。還有學者[26]利用拉曼光譜對活體小鼠口腔上腭黏膜進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜對上腭黏膜各種程度的非典型增生及原位癌具有良好的鑒別能力，靈敏度和特異性均在90%以上，特別是對原位癌和重度非典型增生的鑒別靈敏度和特異性均為100%。Li等[27]對口腔黏膜鱗狀細胞癌和白斑病變組織的拉曼光譜進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常黏膜相比，癌變及白斑黏膜拉曼光譜中核酸及蛋白質(zhì)對應的譜峰明顯增強，通過支持向量機建立鑒別診斷模型，診斷準確率達到95%以上。通過拉曼光譜對舌黏膜的原位癌和浸潤性鱗狀細胞癌的研究也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。在原位癌和浸潤性鱗狀細胞癌的拉曼光譜中，一些蛋白質(zhì)的相關譜峰較正常黏膜增強，可以用來作為鑒別正常組織與癌變組織的依據(jù)；通過統(tǒng)計分析，可以很好地將正常舌黏膜與癌變組織區(qū)分開來，準確率達90%左右[28]。

腮腺腫瘤的術(shù)前診斷一直依賴于細針穿刺活檢技術(shù)，而Yan等[29]的研究為拉曼光譜技術(shù)用于腮腺腫瘤的鑒別診斷提供了理論基礎。Yan等[29]將腮腺多形性腺瘤、Warthin瘤及腮腺正常組織進行拉曼光譜研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：腫瘤組織中核酸和蛋白質(zhì)相關譜峰較正常組織增高，而正常腮腺中的脂類譜峰明顯高于腫瘤組織；以此作為診斷依據(jù)，通過支持向量機對光譜數(shù)據(jù)進行分析，成功鑒別出不同腫瘤及正常腮腺組織，其總體準確率達95%以上。

放射性骨壞死或骨髓炎是頭頸部惡性腫瘤經(jīng)過放射治療后最嚴重的并發(fā)癥之一。臨床上如果能早期鑒別出壞死骨組織和正常骨組織，不僅可以早期診斷，同時可以減少骨組織的切除范圍，為后期修復手術(shù)創(chuàng)造便利條件[1]。McCreadie等[30]對發(fā)生過骨折及正常的股骨頭組織標本進行拉曼光譜研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生過骨折的標本的骨組織成分與正常組有明顯差異，表明拉曼光譜可以鑒別骨組織內(nèi)的病理生理改變。Draper等[31]利用可穿透皮膚的拉曼光譜技術(shù)對小鼠骨骼進行檢測，發(fā)現(xiàn)所得到的光譜與直接暴露的骨骼光譜相似。該技術(shù)是在普通拉曼光譜儀中加入濾波器，將皮膚和肌肉散射的拉曼光譜過濾掉，而只接收深層組織的拉曼光譜[31-32]。這項技術(shù)的應用，使得拉曼光譜應用于臨床檢測體內(nèi)深部組織或器官如骨骼組織等成為可能。Lakshmi等[4]在對下頜骨放射性骨壞死的研究中發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜對骨組織中礦物質(zhì)和有機物等成分的改變敏感，可以用來評價其有機和無機基質(zhì)的破壞或改變。該研究將正常骨組織、放射治療后骨組織和發(fā)生放射性骨壞死的骨組織進行研究，拉曼光譜顯示：發(fā)生放射性骨壞死樣本的無機基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，膠原蛋白變性，成骨細胞和破骨細胞減少；將所得的拉曼光譜通過主成分分析法進行計算，3組之間的拉曼光譜存在明顯差異，提示拉曼光譜可以很好地鑒別經(jīng)過放射治療的骨組織是否發(fā)生放射性骨髓炎或骨壞死。

3 結(jié)束語

拉曼光譜的優(yōu)點如下：1）在病變組織尚未發(fā)生形態(tài)學改變時，拉曼光譜就可檢測出樣本中因細胞增殖、分化或惡變等引起的生物大分子結(jié)構(gòu)、成分和含量的改變，在腫瘤等疾病的早期診斷中有較高的優(yōu)勢；2）拉曼光譜可以實時、無創(chuàng)、快速對疾病進行診斷和檢測，對檢測樣本無需特殊處理，方便快速，樣本可以反復使用，不僅可以檢測常規(guī)病變組織，還可以檢測骨骼和牙齒等高度礦化組織；3）拉曼光譜可以用于分析牙科材料的分子結(jié)構(gòu)和組成，為新材料分析研究提供有力幫助。綜上所述，拉曼光譜技術(shù)在口腔醫(yī)學中具有良好的應用前景。

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