耿士忠，安樹(shù)敏，曾 玲，郭榮顯，薛 穎，蔣遠(yuǎn)遠(yuǎn)，潘志明，焦新安

（揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州225009）

雞白痢（Pullorum disease，PD）是由雞白痢沙門菌（Salmonella Pullorum）引起的一種急性、全身性疾病，也是一種常見(jiàn)傳染病，能引起雛雞高發(fā)病率和高死亡率，是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的疾病之一，并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

目前，除了抗生素，沙門菌活疫苗被普遍認(rèn)為是預(yù)防和治療沙門菌病的有效手段。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)spiC::km 突變株顯著地降低了其致病性，除了能夠激發(fā)體液免疫外，還能夠引起細(xì)胞免疫和黏膜免疫，且細(xì)菌在體內(nèi)只能短暫的生存，很快就被機(jī)體清除。此突變株具有沙門菌減毒活疫苗的特征和要求。本試驗(yàn)旨在從病理學(xué)角度觀察spiC::km 突變株的致病性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌對(duì)雛雞的感染試驗(yàn)

1.1.1 細(xì)菌的準(zhǔn)備 取新鮮培養(yǎng)的spiC::km 突變菌株及野生菌S06004 的單個(gè)菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 min/r 搖振培養(yǎng)10 h，6 000 r/min 離心10 min，收集菌體，用PBS 洗滌細(xì)菌3 次，接種前用1%NaHCO3調(diào)節(jié)細(xì)菌至所需濃度，備用。

1.1.2 接種 將準(zhǔn)備好的細(xì)菌口服接種1 日齡海藍(lán)白雛雞，并設(shè)立不同的濃度細(xì)菌接種組，分別109CFU/mL，108CFU/mL，107CFU/mL，每羽100 μL，5 只/組。設(shè)立野生菌S06004 感染陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組。

1.2 病變觀察

1.2.1 臨床癥狀觀察 接種細(xì)菌后，觀察接種雞的生長(zhǎng)狀況及外在表現(xiàn)，連續(xù)觀察8 d，主要觀察內(nèi)容包括：a：精神不佳；b：嗜睡、羽毛蓬亂；c：腹瀉（白痢）；d：死亡[1-2]。

1.2.2 病理組織學(xué)變化 觀察接種后6 d 試驗(yàn)雞的大體病變，采集試驗(yàn)雞的十二指腸道、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、盲腸等臟器，以10%中性福爾馬林溶液固定，按常規(guī)制備上述臟器的石蠟組織切片，H.E.染色，觀察相應(yīng)的病理變化[3]。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察 觀察結(jié)果表明，spiC::km 突變菌株相比野生菌，幾乎不能引起雞明顯的外在病理表現(xiàn)。在觀察期內(nèi)，野生菌S06004 都能導(dǎo)致典型的白痢腹瀉癥狀，但隨著劑量的增加，導(dǎo)致的死亡數(shù)也在相應(yīng)地增加，即使沒(méi)有死亡的雞也表現(xiàn)出嚴(yán)重白痢腹瀉。從體重上看，spiC::km 突變菌株對(duì)雛雞生長(zhǎng)沒(méi)有影響，和空白對(duì)照組相比，略有增加；而野生菌S06004 作為陽(yáng)性對(duì)照組，該菌則嚴(yán)重影響了雛雞的生長(zhǎng)，體重顯著下降。

2.2 組織切片觀察結(jié)果 野生菌S06004 組：肝臟淤血，脂肪變性，少量肝細(xì)胞凝固性壞死；肺臟也有淤血；十二指腸黏膜絨毛壞死脫落，壞死區(qū)的整個(gè)黏膜層漿膜充血；脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量減少；盲腸黏膜層壞死，黏膜下層充血。

spiC::km 突變菌株組：肝臟輕微脂肪變性；其它組織無(wú)明顯病變，基本正常。

從結(jié)果中可明顯看出，spiC::km 突變菌株引起雛雞病理變化與正常對(duì)照相差不大，與野生菌相比癥狀顯著減輕。進(jìn)一步證明spiC::km 突變菌株相對(duì)野生菌毒力較弱（見(jiàn)中插彩版圖1）。

空白對(duì)照組：無(wú)病理變化。

3 討論

雞白痢沙門菌在我國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)中造成嚴(yán)重的危害[4]，主要是由于該沙門菌除了具有免疫逃逸及水平傳播能力外，還具有垂直傳播的能力，導(dǎo)致防疫困難?，F(xiàn)行有效的防控對(duì)策是生物安全控制和凈化措施，基本原則是淘汰感染雞（群）。根據(jù)我國(guó)的國(guó)情，該措施實(shí)際實(shí)施難度大且代價(jià)昂貴?？股刂委熾m有一定的效果，但不能完全阻止細(xì)菌感染，且長(zhǎng)期使用抗生素已產(chǎn)生了多重耐藥性和藥物蓄積殘留等諸多公共衛(wèi)生問(wèn)題[5]。為此，在我國(guó)及其他發(fā)展中國(guó)家迫切需要探索包括免疫預(yù)防在內(nèi)的新的防控措施。

由于傳統(tǒng)的滅活疫苗免疫效果不佳，免疫途徑不方便而逐漸被淘汰。許多國(guó)家逐漸轉(zhuǎn)向研究活疫苗來(lái)預(yù)防控制沙門菌病，并取得了很好的效果[6]，隨著現(xiàn)代生物學(xué)和DNA 重組技術(shù)的發(fā)展，以及對(duì)沙門菌毒力遺傳學(xué)的深入研究和了解，為在該病原體基因組中進(jìn)行基因敲除制備等位基因突變體具備了可能性，這些突變體為研制沙門菌減毒活疫苗及基因功能研究提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ)[7]。

我們根據(jù)雞白痢沙門菌特有的生物學(xué)特性，運(yùn)用轉(zhuǎn)座突變的方法，發(fā)掘雞白痢沙門菌具有減毒功能的基因決定簇。通過(guò)致病性的比較，雞白痢沙門菌spiC::km 突變株具有顯著的減毒效應(yīng)，說(shuō)明該基因滅活的雞白痢沙門菌具有發(fā)展為減毒活疫苗的潛力。

spiC 基因是沙門菌2 型III 型分泌系統(tǒng)的蛋白之一，其功能已經(jīng)被廣泛研究[8]，但至今末有統(tǒng)一的結(jié)論，有待進(jìn)一步探索。

[1] Wigley P，Hulme S D，Bumstead N，et al.In vivo and in vitro studies of genetic resistance to systemic salmonellosis in the chicken encoded by the SAL1 locus[J].Microbes Infect，2002，4：1111-1120.

[2] Shivaprasad H L.Fowl typhoid and pullorum disease[J].Rev Sci Tech，2000，19：405-424.

[3] 李和，周莉.組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)[M].北京，人民衛(wèi)生出版社，2008：9.

[4] 盧艷，劉蕾，劉文博，等.1 株可形成生物膜雞白痢沙門菌的分離鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46（9）：19-21.

[5] 焦新安，劉秀梵.禽沙門菌病流行現(xiàn)狀與防制對(duì)策[J].中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)刊，1998，15（1）：23-24.

[6] 朱其太.雞沙門菌病的疫苗防治[J].中國(guó)家禽，2000，17（3）10.

[7] Fields P I，Swanson R V，Haidaris C G，et al.Mutants of Salmonella typhimurium that cannot survive within the macrophage are avirulent[J].Proceedings of the National Academy of Science USA，1986，83：5189-5193.

[8] Kuhle V，Hensel M.Cellular microbiology of intracellular Salmonella enterica：Functions of the type IIIsecrection system encoded by Salmonella pathogenicity island 2[J].Cell Mol Life Sci，2004，61：2812-2826.