杜海燕 韓俊偉

(1.新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南 新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,453000)

鏈球菌在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中分布較廣，畜禽體表、消化道、呼吸道、泌尿生殖道及乳汁等都有鏈球菌的存在。鏈球菌的種類繁多，有些是致病菌，可引起人和動(dòng)物的化膿性疾病、肺炎、敗血癥、給畜牧養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生造成了嚴(yán)重威脅。本實(shí)驗(yàn)從規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)采集空氣、排污水、土壤和糞便樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，挑取其中優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，以了解鏈球菌分布情況，為養(yǎng)豬場(chǎng)鏈球菌疫病的預(yù)防與控制提供了重要參考依據(jù)。

1 原始材料采集

空氣樣本采集：配含血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用自然沉降法收集空氣細(xì)菌。豬舍內(nèi)，分別沿豬舍長(zhǎng)軸均勻設(shè)3個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)放置2個(gè)含血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，距地面70cm。采樣10min，同時(shí)記錄當(dāng)時(shí)的氣溫和相對(duì)濕度。場(chǎng)區(qū)及場(chǎng)外：生產(chǎn)區(qū)中心設(shè)1個(gè)點(diǎn)，兩排圈舍間設(shè)2個(gè)點(diǎn)。場(chǎng)外選下風(fēng)向50m設(shè)一個(gè)采樣點(diǎn)。每點(diǎn)放置2個(gè)含血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。操作方法同豬舍內(nèi)。

污水采集：分別在排污口、污水溝設(shè)2個(gè)采樣點(diǎn)，于水面下20cm處采樣，裝入滅菌的采樣瓶中。每個(gè)采樣點(diǎn)采樣2次。

糞便樣本采集：分別在仔豬舍、母豬舍、育肥豬舍采集糞便樣本，裝入滅菌的采樣瓶中。每棟圈舍采樣2次。

土壤樣本采集：分別在仔豬舍內(nèi)、母豬舍內(nèi)、育肥豬舍內(nèi)（或豬舍過(guò)道）、生產(chǎn)區(qū)中心、兩排圈舍間設(shè)1個(gè)采樣點(diǎn)。于土面下10cm處采樣，裝入滅菌的采樣瓶中。每個(gè)采樣點(diǎn)采樣2次。

2 細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)及分離鑒定

2.1 菌落計(jì)數(shù)

空氣中細(xì)菌的計(jì)數(shù)：將含血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿37℃培養(yǎng)24h～48h。分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)平皿中菌落總數(shù)，用奧氏公式C=50000×每皿菌落數(shù)/（平皿面積×采樣持續(xù)時(shí)間）計(jì)算空氣中每立方米菌落總數(shù)。

污水中細(xì)菌的計(jì)數(shù)：取污水樣本1mL，加入9mL生理鹽水中，混勻，吸取1mL注入9mL生理鹽水中，制成10倍數(shù)梯度倍比稀釋液。吸取500μL稀釋后的污水樣本分別置入鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，并用“L”棒涂抹均勻，37℃培養(yǎng)24h～48h。統(tǒng)計(jì)平皿中菌落總數(shù)。

糞便和土壤中細(xì)菌的計(jì)數(shù)：取糞便或土壤樣本1g，加入9mL生理鹽水中，充分混勻后吸取1mL注入9mL生理鹽水中，制成10倍數(shù)梯度倍比稀釋液。吸取500μL注入鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，并用“L”棒涂抹均勻，37℃培養(yǎng)24h～48h。統(tǒng)計(jì)平皿中菌落總數(shù)。

2.2 鏈球菌的分離

從上述原材料中觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況及其菌落特征。對(duì)不同形態(tài)的菌落進(jìn)行挑菌純培養(yǎng)后，涂片染色鏡檢。根據(jù)菌體形態(tài)和染色特性，初步判定細(xì)菌類屬，其中鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性呈圓形或卵圓形，直徑小于2.0μm，排列成鏈狀或成雙的為疑似鏈球菌，將疑似鏈球菌菌落在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上純培養(yǎng)。挑出菌落在鮮血瓊脂培養(yǎng)基中純培養(yǎng)后，若得到生長(zhǎng)狀態(tài)灰白色，表面光滑，邊緣整齊的小菌落。這些菌株就為待檢菌株。用記號(hào)筆在初培養(yǎng)的培養(yǎng)皿和純培養(yǎng)的培養(yǎng)皿上記上相對(duì)應(yīng)的編號(hào)。

2.3 鏈球菌的鑒定

挑取待檢菌株做成涂片革蘭氏染色，置于光鏡下依次從低倍到高倍觀察，可見(jiàn)單個(gè)、成對(duì)或3-4個(gè)菌體排列成短鏈或7-10個(gè)長(zhǎng)鏈狀的球狀菌，但以成對(duì)排列較多。記錄下觀察到的細(xì)菌顏色、形態(tài)、排布狀況等。待檢菌株分別用接種針接種到生化編碼鑒定管。將接種過(guò)的生化鑒定管放入37°C恒溫箱中培養(yǎng)24h后。觀察并記錄結(jié)果。由于鏈球菌的生化反應(yīng)活潑，不同血清型或同一血清型不同菌株之間的生化反應(yīng)有差異，故生化鑒定只能作為補(bǔ)充性鑒定。一般認(rèn)為生化鑒定中意義較大的有：糖發(fā)酵試驗(yàn)：乳糖、蔗糖、甘露醇、纖維二糖、水楊素、七葉苷、甘油和山梨醇水解均為陽(yáng)性；6.5%NaCL中生長(zhǎng)呈陽(yáng)性。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng)特性

分離菌固體培養(yǎng)物以雙球、散在為主。在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)極貧瘠，培養(yǎng)24h后僅在劃線處見(jiàn)有針尖大小的菌落；在血液瓊脂平板上長(zhǎng)成直徑0.1～1.0mm，灰白色或無(wú)色、透明、圓形、濕潤(rùn)、表面光滑、邊緣整齊、針尖大的露滴樣小菌落，且大多為α 或β 溶血。

3.2 鏈球菌分離鑒定結(jié)果

通過(guò)分離培養(yǎng)和生化鑒定，檢測(cè)結(jié)果豬場(chǎng)：空氣中共鑒定30個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落，鏈球菌有6株，占20.00%；排污水樣本中共鑒定18個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落，鏈球菌有3株，占16.67%；糞便中共鑒定17個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落，鏈球菌有2株，占11.76%；土壤中共鑒定22個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落，鏈球菌有4株，占18.18%。

調(diào)查結(jié)果表明，養(yǎng)豬場(chǎng)內(nèi)細(xì)菌總數(shù)基本上未超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)，環(huán)境中都發(fā)現(xiàn)了鏈球菌，且占細(xì)菌總數(shù)的比率比較高，其中環(huán)境中共鑒定87個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落，鏈球菌有15株，所占比率為17.24%（15/87）。根據(jù)調(diào)查結(jié)果和養(yǎng)豬場(chǎng)的具體情況，建議各豬場(chǎng)繼續(xù)堅(jiān)持執(zhí)行衛(wèi)生制度和管理方法。定期對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行消毒，減少圈舍和場(chǎng)區(qū)細(xì)菌含量。定期對(duì)消毒池消毒藥水的更換并準(zhǔn)備多種消毒藥水，防止外來(lái)病原菌的污染以及細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。做好對(duì)豬場(chǎng)大門的管理，防止陌生人員和其它動(dòng)物帶入病原菌。改善飼料配方（在飼料中添加微生態(tài)制劑），對(duì)不同階段豬群合理補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。以增強(qiáng)豬群抵抗力，減少豬場(chǎng)細(xì)菌含量。