何 藺，劉 濤△，王浩宇，任麗蓉

（1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院／南充市中心醫(yī)院心內(nèi)科，四川南充 637000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川瀘州 646000）

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）是一種多功能間葉細(xì)胞，主要參與構(gòu)成肌性動脈血管壁的中膜，其收縮和舒張可以維持血管張力和保持血管完整性。目前有研究認(rèn)為，VSMC從中膜遷移到內(nèi)膜下間隙，增殖并沉淀細(xì)胞外基質(zhì)促使脂質(zhì)條紋轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓睦w維脂質(zhì)斑塊，與動脈粥樣硬化、高血壓和經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)后再狹窄等血管性疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1－3］。因此，在體外條件下分離獲得大量VSMC成為了無數(shù)血管性疾病分子機(jī)制研究的基礎(chǔ)。為提高VSMC原代培養(yǎng)的成功率和可行性，本研究在傳統(tǒng)組織塊貼壁法培養(yǎng)原代細(xì)胞的基礎(chǔ)上進(jìn)行摸索和改進(jìn)，建立了一種簡單、經(jīng)濟(jì)、可靠的小鼠主動脈VSMC原代培養(yǎng)方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體（SPF）C57BL／6小鼠3～4只，雌雄不限，8周齡以上，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司（動物合格證編號：0003281）。

1.1.2 主要試劑 高糖／杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（HG／DMEM）、0.25%胰蛋白酶溶液、青／鏈霉素混合液購自Hyclone公司，胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，鼠抗α－平滑肌肌動蛋白（α－SMA）單克隆抗體購自 Abcam公司，0.01mol／L PBS、封閉用山羊血清、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗購自北京中杉金橋公司，4，6－聯(lián)脒－2－苯基吲哚（DAPI）、Triton X－100購自Sigma公司。

1.1.3 主要器材 超凈工作臺購自Thermo公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Sanyo公司，倒置相差顯微鏡、BX41型熒光倒置顯微鏡購自O(shè)lmypus公司，L420普通離心機(jī)購自Xiang Yi公司，T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、離心管購自Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 原代培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死小鼠，置于75.00%乙醇浸泡消毒3min，仰臥固定于超凈工作臺。用組織剪剪開胸腹部皮膚及肌肉層，換用眼科剪靠近胸部左側(cè)剪開胸骨和膈肌，充分暴露胸腹腔，緊靠脊柱前方用眼科鑷及眼科剪小心鈍性分離取出胸、腹主動脈，并立即放入盛有PBS液（含雙抗）的培養(yǎng)皿內(nèi)。用PBS液反復(fù)浸洗血管2～3遍，浸洗時用彎頭鑷子順血管輕輕滑動擠壓血管，以完全洗去血管內(nèi)外的血污和破損細(xì)胞。取兩把眼科鑷小心夾住血管兩側(cè)，盡量剝除血管外膜的脂肪和纖維組織。用眼科剪縱向剪開血管腔，眼科彎鑷小心擦拭血管內(nèi)膜層，以去除血管內(nèi)皮細(xì)胞，PBS液浸洗。將血管段放入另一培養(yǎng)皿中，加入2～3mL 0.25%胰蛋白酶溶液，預(yù)消化10min后轉(zhuǎn)入完全培養(yǎng)液（含雙抗）中，用眼科剪將血管段剪成1mm2大小的組織塊，邊緣光滑、整齊，將組織塊均勻貼放于25cm2培養(yǎng)瓶底面，組織塊間隔約3～5mm。小心豎起培養(yǎng)瓶，向瓶內(nèi)加入5mL含20.00%FBS的HG／DMEM（含雙抗）培養(yǎng)液，直立靜置于37℃、5.00%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，半開放式絕對靜置培養(yǎng)1.5～2.0h，待組織塊自然貼附于瓶壁后輕輕將培養(yǎng)瓶放平使組織塊逐漸浸沒于培養(yǎng)液中，繼續(xù)半開放式絕對靜置培養(yǎng)3d，避免振動和移動，4～5d時首次換液，后每隔5～7天更換培養(yǎng)液。

1.2.2 傳代培養(yǎng) 吸棄培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，加入2mL PBS液清洗2遍后吸棄，加入1～2mL 0.25%胰蛋白酶溶液，2min后鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞回縮變圓、間隙增大、細(xì)胞團(tuán)開始有脫落時，立即加入含完全培養(yǎng)液3～4mL終止消化，用吸管反復(fù)輕輕地吹打使細(xì)胞脫離瓶壁而懸浮，形成細(xì)胞懸液。靜置15min后，利用差速貼壁法［4－5］，使雜質(zhì)細(xì)胞貼壁，隨后用吸管將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，1200r／min離心3min，棄上清液；加入完全培養(yǎng)液到離心管，用吸管吹散后視細(xì)胞數(shù)量按1∶1～1∶3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。以后的傳代方法相同，傳代周期為5～7d。

1.3 細(xì)胞鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

1.3.1.1 倒置相差顯微鏡 原代及傳代培養(yǎng)時，使用倒置相差顯微鏡常規(guī)觀察VSMC的大體形態(tài)、生長特點及排列方式等。

1.3.1.2 蘇木素－伊紅（HE）染色 將P3代VSMC細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化后以每孔5×104個細(xì)胞接種于內(nèi)置小蓋玻片的24孔板中制作細(xì)胞爬片，放入37℃、5.00%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24.0h后取出細(xì)胞爬片，PBS液洗滌3次、3min／次，95.00%乙醇固定15min，PBS液洗滌2次、3min／次，行HE染色，最后中性樹膠封片，正置顯微鏡下觀察。

1.3.2 免疫熒光鑒定 取P3代VSMC細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化后調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔5×104個細(xì)胞接種于內(nèi)置小蓋玻片的24孔板中，放入37℃、5.00%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24.0h，待細(xì)胞自然貼壁、生長良好時，吸棄培養(yǎng)液，PBS液洗滌3次、3min／次；4.00%多聚甲醛室溫固定15min，PBS液洗滌3次、3min／次；0.10%Triton X－100通透10min，PBS液洗滌3次、3min／次；山羊血清封閉30min，吸棄，不洗；加入鼠抗α－SMA單克隆抗體200μL（稀釋度為1∶500）4℃過夜，PBS液洗滌3次、3min／次；加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗200μL（稀釋度為1∶100）室溫避光孵育1.0h，PBS液洗滌3次、3min／次；DAPI（1μg／mL）避光復(fù)染核10min，抗熒光淬滅劑封片后熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞生長情況 原代培養(yǎng)第5天左右在倒置相差顯微鏡下可觀察到從組織塊邊緣游離出的VSMC（圖1A）；第7～9天大部分組織塊長出細(xì)胞暈，細(xì)胞圍繞組織塊邊緣呈放射狀向外延伸，細(xì)胞大小不等，形態(tài)不規(guī)則（圖1B）；第10～12天，相鄰細(xì)胞暈逐漸相接觸，多數(shù)細(xì)胞伸展呈長梭形，有分枝狀突起細(xì)胞，平行排列成單層或多層重疊，呈典型“峰－谷”樣生長（圖1C）。2周左右時組織塊周圍長出的細(xì)胞相互融合，生長至鋪滿70.00%～80.00%瓶壁時即可進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞生長較快，5d左右細(xì)胞再次長成致密單層鋪滿瓶底。經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)和反復(fù)人工純化，VSMC的生長越來越占優(yōu)勢，傳至3～4代時即可用于后續(xù)實驗。

圖1 VSMC原代培養(yǎng)（×100）

圖2 VSMC HE染色

2.2 VSMC HE染色觀察 HE染色后正置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞界限清楚，VSMC呈梭形、細(xì)胞質(zhì)豐富、細(xì)胞質(zhì)著粉紅色，細(xì)胞質(zhì)近中央處有大而圓形或橢圓形的胞核，著藍(lán)紫色（圖2A），細(xì)胞融合區(qū)域可見細(xì)胞相互平行排列，呈旋渦狀或“峰－谷”樣生長（圖2B）。

2.3 VSMC免疫熒光鑒定 培養(yǎng)的P3細(xì)胞經(jīng)特異性α－SMA免疫熒光檢測顯示細(xì)胞具有正常的α－SMA陽性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)著綠色熒光，細(xì)胞核藍(lán)染，高倍鏡下可見肌動蛋白呈綠色條束狀，細(xì)胞形態(tài)完整、胞核輪廓清晰（圖3），培養(yǎng)的VSMC細(xì)胞陽性率達(dá)98.0%以上，細(xì)胞純度較好。

圖3 VSMC免疫熒光α－SM actin染色（×400）

3 討 論

VSMC的異常增殖和遷移是損傷性血管疾病的主要病理學(xué)特征，近年來，隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，以VSMC為主要實驗對象，研究血管性疾病的發(fā)病環(huán)節(jié)，探索與其密切相關(guān)的VSMC增殖和遷移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是目前研究的熱點［1－3，6］，而具有良好生長狀態(tài)的離體 VSMC也成為該類實驗研究的重要條件。

傳統(tǒng)VSMC的原代培養(yǎng)方法主要包括酶消化法和組織塊貼壁法［7－8］，前者培養(yǎng)周期短、細(xì)胞獲得量較多，但因其操作繁瑣、酶作用時間及酶作用濃度不易掌握、實驗成本相對較高等［9－11］，未能得到多數(shù)實驗研究的采用；后者操作簡單，且較為經(jīng)濟(jì)和有效，被廣泛用于VSMC的原代培養(yǎng)。但傳統(tǒng)組織塊貼壁法也因其培養(yǎng)周期長、組織塊貼壁不佳、含有太多雜質(zhì)細(xì)胞等而成為阻礙研究實驗進(jìn)行的因素之一。本研究主要參照傳統(tǒng)組織塊貼壁法，經(jīng)過反復(fù)試驗摸索后對其進(jìn)行改良，一方面在取材獲得完整血管中膜層組織后，加入0.25%胰蛋白酶溶液對其進(jìn)行預(yù)消化處理，目的在于破壞組織的細(xì)胞間質(zhì)蛋白［12］，使緊密的組織結(jié)構(gòu)變得疏松伸展，減少細(xì)胞“突破生長”［13］的阻力，有利于組織塊貼壁后細(xì)胞盡快從組織塊邊緣游離出。另一方面，與傳統(tǒng)組織塊貼壁法不同的是，本研究將組織塊均勻種植于培養(yǎng)瓶底面后，沒有將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)平放于培養(yǎng)箱等待組織塊干涸貼壁，而是小心豎起培養(yǎng)瓶，使組織塊與瓶壁間多余的液體順勢流出，可大大縮短組織塊自然貼附于瓶壁所需時間，并能起到很好的粘貼效果；豎起培養(yǎng)瓶后向瓶內(nèi)加入的培養(yǎng)液可保持組織塊所需的濕性環(huán)境，在一定程度上可防止組織塊過度干涸而影響其生物學(xué)活性；每次傳代時反復(fù)采用15min差速貼壁法，盡可能去除貼壁較快的成纖維細(xì)胞，從而提高VSMC的純度。

為保證實驗的成功率，在操作中還應(yīng)該注意：嚴(yán)格的無菌觀念，無菌操作是保證細(xì)胞體外生存的首要條件［14］；熟練掌握小鼠主動脈血管的解剖方法，盡量縮短取材的時間，從而保證細(xì)胞的生物學(xué)活性；開始培養(yǎng)前3天絕對靜置培養(yǎng)，切勿反復(fù)察看或移動培養(yǎng)瓶，首次換液時發(fā)現(xiàn)漂浮組織塊應(yīng)及時吸棄，以免其對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用；傳代培養(yǎng)時應(yīng)注意把握胰蛋白酶的消化時間及吹打方式，避免消化過度及吹打過猛而損傷細(xì)胞活性。用本研究改良組織塊貼壁法培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定細(xì)胞形態(tài)及狀態(tài)良好，經(jīng)平滑肌細(xì)胞特異性α－SMA免疫熒光檢測顯示細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)陽性，表明本研究所培養(yǎng)的細(xì)胞為VSMC，實驗結(jié)果較為理想，可為后續(xù)VSMC相關(guān)的實驗研究提供可靠的基礎(chǔ)保障。

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