崔廣賓，李曉武，苗建軍，王 金，王桂嶺，尚培中△

（1.河北北方學院研究生院，河北張家口 075000；2.中國人民解放軍第251醫(yī)院普通外科，河北張家口 075000）

編者按：尼古丁不僅僅存在于煙葉之中，也存在于多種茄科植物的果實之中，隨著科學的不斷進步，人們認識到尼古丁并不是香煙致癌的罪魁禍首，微量的尼古丁并不直接對人體造成危害。目前已有臨床研究證明，尼古丁有望成為治療老年癡呆癥、帕金森癥、抑郁癥的有效藥物。

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是指多種病因引起的胰酶激活，繼以胰腺局部炎性反應為主要特征，伴或不伴有其他器官功能改變的疾?。?］。輕度急性胰腺炎（MAP）大多數(shù)患者的病程呈自限性，而重度急性胰腺炎（SAP）起病急、病勢兇險，短期內即可引起組織器官氧化損傷、級聯(lián)瀑布式炎性反應，最終導致多器官功能障礙綜合征（MODS），病死率高達36%～50%［2］。近年的研究表明，炎癥細胞、細胞因子和炎癥介質在SAP的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［3］。最近的一項研究表明，樹突狀細胞（DCs）是AP中胰腺存活必不可少的細胞，可以保護器官免受細胞應激的影響［4］。DCs是體內功能最強的抗原提呈細胞（APC），作為適應性免疫應答的啟動者，在機體抗炎反應中發(fā)揮重要作用。DCs的成熟狀態(tài)對其發(fā)揮免疫效應起到了至關重要的作用。尼古丁又名煙堿，是煙草中含氮生物堿的主要成分。在一項關于尼古丁減輕急性肺損傷的研究中，實驗人員證實了尼古丁的抗炎作用［5］。本研究通過建立SAP模型，觀察經(jīng)過尼古丁的處理后，SAP小鼠脾臟中DCs以及血清中IL－6、IL－10、TNF－α水平的變化程度以及對SAP小鼠病死率的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性清潔級BALB／c小鼠100只，體質量（20±1）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，常規(guī)喂養(yǎng)，實驗前12h禁食，自由飲水；尼古丁、L－精氨酸購自美國Sigma公司。實驗時用0.9%的生理鹽水將尼古丁配成不同劑量（0.1、0.2、0.3mg／kg）的溶液；膠原酶D（美國Sigma公司），小鼠淋巴細胞分離液（北京昊成天翔商貿有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)液與熱滅活胎牛血清（北京思塞因科技有限公司），DC陰選試劑盒（美國BD公司），小鼠抗DC（CD11c微磁珠），DC表面單克隆熒光抗體Fc阻斷劑——純化大鼠抗小鼠CD16／CD32（FcγⅢ／Ⅱ－R）抗體、抗 CD11c單克隆抗體－別藻藍蛋白（CD11c－APC）、抗CD45RB單克隆抗體－藻紅蛋白（CD45RB－PE）和異硫氰酸熒光素（FITC）標記抗小鼠CD40、CD80、CD86、I－a／e（美國BD Biosciences Pharmingen公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及實驗分組 參照文獻［6］方法建立小鼠SAP模型，分2次腹腔注射8%L－精氨酸（40mg／kg），間隔1h，對照組按同樣方法注射0.5mL生理鹽水。按照隨機分配原則將動物分為對照組、SAP組、尼古丁干預組（0.1、0.2、0.3 mg／kg），各組再隨機分成0、12、24、48、96h等5個亞組，每個亞組4只小鼠。

1.2.2 標本采集與處理 分別在每個時間點摘除眼球取血0.5～1.0mL，離心后留血清－20℃下保存待測。之后，固定小鼠于仰臥位，沿腹中線依次切開皮膚、腹壁各層進入腹腔，暴露脾臟，鈍性取被膜脾臟，置入盛有PBS液的平皿中用于提取DCs。因L－精氨酸引起的胰腺炎模型，胰腺組織改變是均一性的，因此隨機選取胰腺組織浸泡于4%多聚甲醛用于病理檢測。

1.2.3 小鼠脾細胞的分離及單個核細胞的制備 留取脾臟，剪碎組織，用研磨棒于220目金屬網(wǎng)上研磨。將細胞懸液貼15.0mL離心管壁小心加入到小鼠淋巴細胞分離液上，20℃、1500r／min離心15min，吸取中層絮狀物，置于離心管中，加4倍D－PBS緩沖液重懸，4℃、1000r／min離心10min，去除多余的淋巴細胞分離液，所得細胞即為小鼠脾臟單個核細胞。

1.2.4 磁珠孵育和磁性分選脾臟CD11clowCD45RBhighDCs使用DCs陰選試劑盒分選獲得DCs，具體操作嚴格按說明書進行。富集的小鼠脾臟DCs不含抗體及磁珠，細胞計數(shù)后用于后續(xù)實驗。CD11clowCD45RBhighDCs的純化通過抗CD11c磁珠選出。

1.2.5 熒光抗體染色 將1.2.4中的CD11clowCD45RBhighDCs孵育24h，連同孵育液一并加入流式管，離心，吸取上清，－70℃保存。加入100μL PBS重懸離心后沉淀的細胞，調整細胞密度為2×105個／mL，加入Fc阻斷劑1μL，4℃孵育15 min；分 別 加 入 5μL CD11c－APC、CD45RB－PE、CD40－FITC、CD80－FITC、CD86－FITC、I－a／e－FITC，避光孵育15min；加入2 mL PBS洗滌1次，離心后去上清，加入0.4mL PBS，采用流式細胞儀檢測相關標記物。

1.2.6 血清中細胞因子水平的檢檢測 所有全血立即37℃恒溫孵育15min，3000r／min離心10min，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL－10、IL－6及TNF－α的表達水平，每組設3個復孔。

1.2.7 觀察尼古丁對SAP小鼠病死率的影響 取60只小鼠，分成5組，每組12只，按照1.2.1中分組方法，分別觀察在0、12、24、48、96h小鼠死亡數(shù)量，最長持續(xù)到第8天。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠脾臟DCs分離與亞群鑒定 用標染的CD11c－APC和CD45RB－PE對分選所得的DCs同時進行染色，染色滿意后采用流式細胞儀進行分析，結果顯示所得DCs分為3群，即CD11clowCD45RBhighDCs、CD11chighCD45RBlowDCs和CD11clowCD45RBlowDCs。采用磁珠分選技術獲取CD11clowCD45RBhighDCs，流式細胞術檢測存活率大于90%。見圖1。

圖1 細胞亞群流式細胞圖

2.2 尼古丁刺激后小鼠脾臟中DCs亞群分化的比例變化與SAP組比較，12h時尼古丁干預組R1數(shù)量變化不顯著，R2數(shù)量顯著增加，而在24、96h，尼古丁干預組的R1數(shù)量較SAP組降低，在24、48、96h時，R2數(shù)量顯著增加。見表1。

表1 尼古丁刺激后小鼠脾臟中DCs亞群分化的比例（，%）

表1 尼古丁刺激后小鼠脾臟中DCs亞群分化的比例（，%）

a：P＜0.05，與SAP組比較。

區(qū)域尼古丁組R1 36±2 36±3 40±4 34±2a 12h SAP組 0.3mg／kg尼古丁組24h SAP組 0.3mg／kg尼古丁組48h SAP組 0.3mg／kg尼古丁組96h SAP組 0.3mg／kg 33±2 30±3 30±2 28±3 R2 14±4 18±1a 12±3 20±2a 15±4 25±2a 17±2 34±3a

表2 各組血清中IL－10水平的變化（，pg／mL）

表2 各組血清中IL－10水平的變化（，pg／mL）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與 SAP組比較，c：P＜0.05，與0.1mg／kg組比較。

組別4±2 5±2 4±3 7±1 6±3 SAP組 159±28a108±21a99±27a175±19a121±23a尼古丁組0.1mg／kg 151±24b 111±19119±24b 196±28b 132±19b 0.2mg／kg 139±31b 129±29bc 136±21bc 239±34bc 120±24c 0.3mg／kg 161±31c 135±17bc 155±25b＃ 269±21bc 195±190h 12h 24h 48h 96h對照組bc

2.3 尼古丁刺激后SAP小鼠血清中細胞因子的變化 SAP小鼠血清中L－10、TNF－α與IL－6水平較對照組小鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經(jīng)尼古丁刺激后，血清中TNF－α與IL－6水平較SAP組小鼠明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；IL－10水平明顯升高，并且呈現(xiàn)劑量依賴效應（P＜0.05）。見表2～4。

表3 各組血清中TNF－α水平的變化（，pg／mL）

表3 各組血清中TNF－α水平的變化（，pg／mL）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與 SAP組比較；c：P＜0.05，與0.1mg／kg比較。

組別9±4 8±3 10±5 9±2 8±5 SAP組 25±2a408±21a399±27a175±19a121±23a尼古丁組0.1mg／kg 29±4374±28b 371±12b 207±10b 99±24b 0.2mg／kg 27±5415±17327±19bc 161±19bc 109±31b 0.3mg／kg 24±3289±17bc 295±25bc 109±21bc 55±190h 12h 24h 48h 96h對照組bc

2.4 尼古丁降低SAP小鼠病死率 為了驗證尼古丁可以改善SAP小鼠的病死率，本研究觀察了尼古丁干預后SAP小鼠病死率的變化。如圖2所示，與未注射尼古丁的小鼠相比，0.1 mg／kg尼古丁干預模型小鼠的病死率略有下降。而0.3mg／kg尼古丁干預顯著降低SAP小鼠病死率（P＜0.05），而0.1 mg／kg和0.2mg／kg尼古丁的保護作用表現(xiàn)卻不明顯（P＞0.05）。

表4 各組血清中IL－6水平的變化（，pg／mL）

表4 各組血清中IL－6水平的變化（，pg／mL）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與SAP組比較；c：P＜0.05，與0.1mg／kg比較。

組別26±4 31±3 27±3 25±2 31±4 SAP組 29±3108±21a199±27a175±19a121±23a尼古丁組0.1mg／kg 26±694±17b 160±20b 160±23b 111±16b 0.2mg／kg 31±5101±22b 139±27bc 151±18bc 109±23bc 0.3mg／kg 27±389±17bc 145±25bc 109±21bc 95±190h 12h 24h 48h 96h對照組bc

圖2 尼古丁降低SAP小鼠病死率

3 討 論

SAP是臨床一種常見的急危重癥，單純的支持療法或者手術治療并未能顯著降低器官損害的發(fā)生率以及SAP病死率。SAP治療經(jīng)歷了一些重要變革，包括早期液體復蘇、預防性抗菌藥物應用、血液濾過等部分治療手段，但是從總體治療的效果來看，治療手段日新月異并沒有帶來臨床結局的顯著改善［6］。胰腺炎是一種炎癥性疾病，炎性反應是SAP早期重要的病理變化，過度的炎性反應引起的炎癥反應綜合征的發(fā)生是導致器官損傷甚至SAP早期死亡的主要原因。因此，有效調節(jié)早期超強的炎性反應及控制后期感染和內毒素血癥的發(fā)生是治療SAP的關鍵。

CD11clowCD45RBhighDCs是由Groux等［7］于1999年從IL－10轉基因小鼠和正常BalB／c、C57BL／6小鼠的脾臟內分離出的一個DCs的亞群。該群細胞存在于正常小鼠的脾臟及淋巴結內，特別在IL－10轉基因的小鼠中。CD11clowCD45RBhighDCs通過分泌IL－10抑制機體的炎性反應，本研究也同樣發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。

近年來的研究證實膽堿能抗炎癥通路（CAP）是一種神經(jīng)－免疫調節(jié)通路，迷走神經(jīng)及其遞質乙酰膽堿（Ach）與免疫細胞上煙堿型膽堿能受體（nAchR）結合，通過細胞內信號傳導途徑抑制炎性因子的釋放，從而防止炎性過度反應。尼古丁作為nAchR的激動劑，具有的抗炎作用引起了作者的重視。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過尼古丁干預后SAP小鼠體內的CD11clowCD45RBhighDCs明顯增加，同時，血清中IL－10水平顯著升高，IL－6和TNF－α的水平明顯降低。更為重要的是，經(jīng)過尼古丁的干預明顯增加了SAP的存活率，對SAP表現(xiàn)出保護作用。有研究人員在膿毒癥模型中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，尼古丁可以抑制促炎因子的釋放，提高膿毒癥大鼠的存活率［8］。而與Aicher等［9］研究相反，他們發(fā)現(xiàn)尼古丁可以通過α7nAChR激活DCs，并且促進DCs成熟，從而活化T細胞啟動免疫反應，尼古丁的這些作用可能是導致動脈粥樣硬化繼續(xù)進展的主要原因。作者認為產(chǎn)生這種矛盾現(xiàn)象的根本原因是DCs的分化狀態(tài)不同所導致的。在本實驗中，經(jīng)過尼古丁的刺激，小鼠體內的CD11clowCD45RBhighDCs顯著增加，對應的IL－10顯著升高，抑制了體內炎性反應的繼續(xù)進展，另一方面，CD11clowCD45RBhighDCs的數(shù)量卻是降低的，此亞群主要以分泌IL－12為主，促進機體發(fā)生炎性反應。由此，推測尼古丁可能促進DCs向CD11clowCD45RBhighDCs發(fā)展，從而減弱SAP的炎性反應，增加SAP小鼠的生存率。

總之，本實驗結果提示干預膽堿能抗炎通路對SAP具有一定的保護作用。但尼古丁對SAP的預防和保護作用的機制還有待進一步研究。不過相信隨著對膽堿能抗炎通路與SAP相互關系的深入研究，困擾人們的問題終將得到解釋。而膽堿能抗炎通路也有可能成為治療SAP的有效措施，為SAP的治療開啟新的篇章。

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