李培林++郭海平++哈申高娃++郭冠萍++趙子紅

摘要：分別用幾組不同溫度（37、38、39、40、41、42 ℃）的水浴來(lái)復(fù)蘇BHK-21細(xì)胞，研究不同溫度對(duì)BHK-21細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，在溫度為38、39 ℃時(shí)，復(fù)蘇細(xì)胞的平均活力分別為99.8%、99.6%，說(shuō)明了復(fù)蘇溫度與活力的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：BHK-21細(xì)胞；復(fù)蘇；細(xì)胞活力

中圖分類(lèi)號(hào)：Q813.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2015）06-0010-02

動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是指在人工條件下，高密度、大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)生物技術(shù)產(chǎn)品，生產(chǎn)中為了使細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)更加良好，并且能夠穩(wěn)定傳代同時(shí)避免污染或發(fā)生細(xì)胞變異，因此，需要一種快速有效的復(fù)蘇手段去復(fù)蘇細(xì)胞。復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速度將體外的培養(yǎng)物或生物活性物質(zhì)恢復(fù)到常溫下的過(guò)程，不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞，還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)?shù)臏囟认聫?fù)蘇。細(xì)胞復(fù)蘇的溫度一般是在37～42 ℃，不同溫度的水浴對(duì)復(fù)蘇BHK-21細(xì)胞活力有著一定的影響，本試驗(yàn)就此進(jìn)行了復(fù)蘇溫度和活力相關(guān)性的分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 連續(xù)傳代的常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，按《BHK-21細(xì)胞凍存規(guī)程》凍存F68代細(xì)胞，由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 45%的乳漢液（本公司自配），45%的MEM（北京清大天一生物技術(shù)有限公司），10%的犢牛血清（山西太原生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 儀器設(shè)備 液氮罐（YDS-30-125F）購(gòu)自山樂(lè)山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司，倒置顯微鏡（CKX41）OLYMPUS，T75小方瓶，水浴，小離心管。超凈工作臺(tái)（XJ-1450）購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)培養(yǎng)基配制 將45%的乳漢液和45%的MEM混合均勻，加入10%的犢牛血清，再加入1%的碳酸氫鈉，1%的雙抗，0.5%的谷氨酰胺，分別倒入6個(gè)T75的方瓶中，每瓶30 mL，備用。

1.2.2 BHK-21細(xì)胞的復(fù)蘇 ①調(diào)配37～42 ℃的溫水。②從液氮中取出凍存管，立刻投入37～42 ℃的溫水中迅速晃動(dòng)，直至凍存液完全溶解。③將細(xì)胞凍存液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入5 mL的培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻。④將細(xì)胞液經(jīng)720 r/min離心，棄去上清液。⑤向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù) 按《細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)手冊(cè)》（北京清大天一公司）介紹的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)：①將細(xì)胞計(jì)數(shù)板擦拭干凈，蓋玻片用無(wú)水乙醇預(yù)先浸泡后擦拭干凈，蓋于計(jì)數(shù)室上方。②取1 mL的臺(tái)盼藍(lán)放入小離心管內(nèi)，取1 mL細(xì)胞液也放入此離心管內(nèi)，吹打均勻，染色數(shù)分鐘。③將已染好的細(xì)胞液吸出，沿蓋玻片邊緣自然滲入，使懸液充滿(mǎn)蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間，不要留有氣泡，也不要外溢。④靜置，顯微鏡下觀(guān)察計(jì)數(shù)板四角大方格中細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞壓中線(xiàn)時(shí)，一般遵循“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”的原則。將計(jì)數(shù)結(jié)果按以下公式計(jì)算：

細(xì)胞活力=（細(xì)胞總數(shù)-活細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

從表1中可以看出，細(xì)胞在38、39 ℃下的細(xì)胞平均活力為99.8%和99.6%，明顯高于其他四組水溫下的細(xì)胞平均活力，說(shuō)明38、39 ℃的水溫是復(fù)蘇細(xì)胞的最佳溫度。從圖1中可知，復(fù)蘇水溫在38、39 ℃時(shí)，曲線(xiàn)相對(duì)平穩(wěn)，細(xì)胞的活力相對(duì)穩(wěn)定，而且活力明顯要高。其他幾組曲線(xiàn)起伏波動(dòng)較大，而且活力較低。因此可見(jiàn)，復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，水溫控制在38、39 ℃時(shí)，細(xì)胞活力較高。

3 小結(jié)與討論

（1）在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，一般以很快的速度升溫，1～2 min即可恢復(fù)到常溫下，細(xì)胞內(nèi)不會(huì)重新形成較大結(jié)晶，也不會(huì)暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，從而無(wú)結(jié)晶損傷和溶質(zhì)損傷，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞凍存懸液一旦溶解后，要盡快去除凍存保護(hù)液，防止凍存保護(hù)液對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。

（2）在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，水溫應(yīng)該控制在38 、39 ℃下時(shí)細(xì)胞活力較高，細(xì)胞活力的高低是衡量細(xì)胞生命力的重要標(biāo)志，也極大程度上影響著以后細(xì)胞的增殖，細(xì)胞的增殖是活細(xì)胞的重要生理功能，也是生物體的重要生命特征之一，是生物體生長(zhǎng)發(fā)育，繁殖及遺傳的基礎(chǔ)。