李增++趙俊++王明麗

摘要：采用分子量為20 kD單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯（mPEG-SC）修飾重組豬α干擾素，初步研究了修飾反應(yīng)條件及分離純化工藝。結(jié)果表明，單修飾PEG-IFNα的轉(zhuǎn)化率達到65%，單修飾產(chǎn)品純度達到97%。由于修飾產(chǎn)物相對分子質(zhì)量和不均一性的增加，導致其體外杭病毒活性降低，抗病毒活性保留達到未修飾重組豬α干擾素的29%，仍然具有良好的抗病毒作用。

關(guān)鍵詞：聚乙二醇；重組豬α干擾素；修飾

中圖分類號：S828 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2015）06-0005-02

PEG（聚乙二醇）是一種中性、水溶性、無毒性的聚合物。在水溶液中長鏈的PEG分子，具有高水合性，可以附著到其他分子和表面上，提供了一個生物相溶的、保護性外殼。這種保護性外殼降低了生物系統(tǒng)對這些材料的清除能力，極大的降低了蛋白質(zhì)、細胞和細菌的吸附，降低了腎臟的清除率。PEG在水和許多有機溶劑中可溶，在水溶液中它和其他聚合物如葡聚糖一起可形成雙相系統(tǒng)。雙功能PEG的水溶性、無毒性、高柔性和特征明確的化學特性，使它成為理想的修飾蛋白類產(chǎn)品的交聯(lián)材料[1]。PEG與干擾素的偶聯(lián)已廣泛應(yīng)用于用于臨床。如先靈葆雅公司開發(fā)的聚乙二醇化人干擾素α-2β（商品名，佩樂能，PegIntron）；羅氏公司開發(fā)的聚乙二醇化人干擾素α-2β（商品名，派羅先，PegasyS）等。已經(jīng)證實被偶聯(lián)后的干擾素，生物學活性大部分得以保留，同時免疫應(yīng)答極大地降低，血清半衰期也極大地得到了延長。

動物α型干擾素對畜禽病毒性疾病具有較好的防治效果。安徽醫(yī)科大學微生物學教研室采用基因工程技術(shù)克隆并表達了豬α型干擾素，并將實驗室合格產(chǎn)品制成凍干粉針劑發(fā)送至安徽省多家養(yǎng)豬場進行臨床試驗。結(jié)果證明，該室研制的重組豬α干擾素能有效治療豬病毒性疾病。對治療豬病毒性腹瀉有效率為83.5%，治愈率為63.9%。在該項目的基礎(chǔ)上，對重組豬α干擾素進行聚乙二醇化修飾，以獲得長效制劑，從而延長藥物在體內(nèi)循環(huán)半衰期、減少體內(nèi)清除率，減少給藥次數(shù)、降低動物的應(yīng)激性、增強療效、降低用藥成本。作為新型獸藥的開發(fā)這一項目有重要的學術(shù)價值和應(yīng)用前景，同時具有較高的社會效益和經(jīng)濟效益。

本研究采用分子量大、反應(yīng)條件溫和的20 kΔ單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯（μ∏EΓ-∑X）修飾劑對重組豬α干擾素進行了修飾（圖1），并通過控制反應(yīng)條件，期望獲得半衰期更長、更穩(wěn)定，且體外活性保留較高的∏EΓ化重組豬α干擾素產(chǎn)物。且對該單修飾產(chǎn)物進行了純度、體外抗病毒活性進行了檢測，為進一步考察其藥代動力學和藥效學性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原料：單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯（mPEG-SC），重組豬α干擾素。

儀器：Amersham Pharmacia公司的AKT A Explorer 色譜系統(tǒng)；北京六一儀器廠的DYY-Ⅲ -4穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。

試劑：牛血清白蛋白；甲叉丙烯酰胺； 丙烯酰胺、SDS；考馬斯亮藍R250； RRMI 1640培養(yǎng)基；小牛血清； 其余試劑均為國產(chǎn)分析純或生化純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 聚乙二醇-重組豬α干擾素的制備與純化 干擾素用5 mmol/L pH3.0～5.0的磷酸二氫鉀緩沖液稀釋到0.1 mg/mL；加入計算量的干擾素，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到8.0，按干擾素：mPEG為1∶20的物質(zhì)的量加入1/4量的mPEG-SC，在0～4 ℃條件下反應(yīng)，隨后每間隔2 h加入1/4量的mPEG-SC，加入完畢后繼續(xù)反應(yīng)4 h，加入0.75 mol/L的甘氨酸1 mL終止反應(yīng)；隨后將上述反應(yīng)液用5倍量體積、濃度為50 mmol/L pH 7.2的醋酸鈉緩沖液稀釋，然后上Superdex 75 Highload制備型凝膠色譜柱（26 mm×600 mm， 22～24μm），以5倍體積pH 7.2的醋酸鈉緩沖液洗柱后，用含0.5 mol/L NaCl的醋酸鈉緩沖液洗脫，收集含PEG-干擾素的洗脫液，濃縮，SDS-PAGE電泳檢測。用Superdex 200對“（1）”中得到PEG化干擾素進一步純化，洗脫液為pH 7.2的醋酸鈉緩沖液（含0.2 mol/L NaCl），用波長為280 nm的紫外吸收檢測，收集含PEG-干擾素的洗脫液，濃縮。

1.2.2 SDS-PAGE電泳法對產(chǎn)物的檢測 對濃縮的各洗脫峰采用SDS-PAGE電泳檢測，分離膠10%，濃縮膠5%。電泳結(jié)束后，將膠體固定（固定液：30%甲醇、5%乙酸）室溫搖動染色1 h（染色液：0.05%考馬斯亮藍、30%甲醇、5%乙酸）；最后將膠體移入脫色液（脫色液：1%戊二醛、30%甲醇、5%乙酸）中室溫搖動浸泡直至條帶清晰為止。

1.2.3 蛋白濃度的測定 以牛血清蛋白為標準，按Lowry法[3]測定濃縮后的蛋白濃度。

1.2.4 抗病毒活性的測定 采用WISH-VSV系統(tǒng)檢測干擾素的抗病毒活性[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚乙二醇-重組豬α干擾素的制備與純化

豬α干擾素的等電點在6.2左右，經(jīng)聚乙二醇修飾后，等電點有所降低，因此可采用離子交換層析的方法對反應(yīng)產(chǎn)物進行分離純化。結(jié)果如圖2所示，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明，修飾后產(chǎn)物分離組分（聚乙二醇-重組豬α干擾素）呈單一條帶，純度能夠達到97%。對條帶3反應(yīng)原液各組分經(jīng)光密度計算可知反應(yīng)修飾率能夠達到65%。

2.2 聚乙二醇-重組豬α干擾素抗病毒活性

對WISH細胞用不同劑量的修飾干擾素進行處理，24 h后吸棄，再分別接種100 TCID50的VSV病毒。結(jié)果表明，聚乙二醇修飾后的重組豬α干擾素能夠明顯抑制VSV引起的細胞病變，通過效價測定（表1），所得的單修飾產(chǎn)物活性保留達到了29%。

3 討論

蛋白質(zhì)分子中的氧基有較高的親核反應(yīng)活性，而含有氨基的氨基酸主要有Lys和氮末端的氨基，對大部分蛋白來說，通常賴氨酸含量比較高，因而賴氨酸的氨基是最易被PEG修飾的位點[5]。?；疨EG里包括經(jīng)常使用的mPEG-SC、mPEG-SS。其中，自從90年代初開始開發(fā)mPEG-SC以來，由于其與蛋白反應(yīng)時條件溫和，應(yīng)用的最多。

本研究采用分子量為20 000 的單mPEG-SC對重組豬α干擾素進行了修飾。干擾素與干擾素修飾產(chǎn)物之間的主要差別之一是分子量的差異，因此本實驗采用凝膠過濾色譜分離純化聚乙二醇修飾重組豬α干擾素。這種分離模式是已經(jīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，工藝成熟。利用該分離條件，我們成功的純化獲得聚乙二醇修飾重組豬α干擾素。此分離純化模式相對比較穩(wěn)定，回收率較為理想，一方面滿足了后續(xù)聚乙二醇修飾重組豬α干擾素性質(zhì)研究的需要，另一方面為它走向工業(yè)生產(chǎn)進行嘗試，希望能為聚乙二醇修飾重組豬α干擾素產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)提供參考?？共《净钚匝芯克玫男揎棶a(chǎn)品中IFN體外抗病毒活性隨著修飾后相對分子質(zhì)量的增加而降低，但活性保留達到了29%，仍然具有良好的抗病毒活性。

在本研究中，實驗的反應(yīng)條件溫和可控，對氮端修飾率高，分離純化工藝簡單，收率高，可獲得高純度高均一性的樣品，確定了定點修飾干擾素的先導化合物，為后續(xù)開發(fā)研究工作奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] PASUT G，VERONESE F M.State of the art in PEGylation： The great versatility achieved after forty years of research [J]. J Control Release，2012，161（2）：461-472.

[2] 趙 俊，張俊玲，李 增，等. 重組豬干擾素α1凍干粉針劑對豬的安全性試驗研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014（1）： 195-198.

[3] 閆 萍，楊 琦，王惠珍，等. 改良Lowry法和Bradford法測定蚯蚓提取物中蛋白質(zhì)含量的比較[J]. 山西醫(yī)科大學學報，2006 （1）：9-11.

[4] 中華人民共和國衛(wèi)生部.中國生物制品規(guī)程. 一部[M]. 北京：中國人口出版社，1995. 268-269.

[5] 楊 旭，貢 濟. 宇蛋白多肽類藥物聚乙二醇化修飾研究進展[J]. 中國當代醫(yī)藥，2012，31（19）：16-20.