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        重組豬α干擾素的聚乙二醇修飾研究

        2015-08-13 10:07:39李增趙俊王明麗
        湖北畜牧獸醫(yī) 2015年6期
        關(guān)鍵詞:聚乙二醇干擾素

        李增++趙俊++王明麗

        摘要:采用分子量為20 kD單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEG-SC)修飾重組豬α干擾素,初步研究了修飾反應(yīng)條件及分離純化工藝。結(jié)果表明,單修飾PEG-IFNα的轉(zhuǎn)化率達(dá)到65%,單修飾產(chǎn)品純度達(dá)到97%。由于修飾產(chǎn)物相對分子質(zhì)量和不均一性的增加,導(dǎo)致其體外杭病毒活性降低,抗病毒活性保留達(dá)到未修飾重組豬α干擾素的29%,仍然具有良好的抗病毒作用。

        關(guān)鍵詞:聚乙二醇;重組豬α干擾素;修飾

        中圖分類號:S828 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1007-273X(2015)06-0005-02

        PEG(聚乙二醇)是一種中性、水溶性、無毒性的聚合物。在水溶液中長鏈的PEG分子,具有高水合性,可以附著到其他分子和表面上,提供了一個生物相溶的、保護(hù)性外殼。這種保護(hù)性外殼降低了生物系統(tǒng)對這些材料的清除能力,極大的降低了蛋白質(zhì)、細(xì)胞和細(xì)菌的吸附,降低了腎臟的清除率。PEG在水和許多有機(jī)溶劑中可溶,在水溶液中它和其他聚合物如葡聚糖一起可形成雙相系統(tǒng)。雙功能PEG的水溶性、無毒性、高柔性和特征明確的化學(xué)特性,使它成為理想的修飾蛋白類產(chǎn)品的交聯(lián)材料[1]。PEG與干擾素的偶聯(lián)已廣泛應(yīng)用于用于臨床。如先靈葆雅公司開發(fā)的聚乙二醇化人干擾素α-2β(商品名,佩樂能,PegIntron);羅氏公司開發(fā)的聚乙二醇化人干擾素α-2β(商品名,派羅先,PegasyS)等。已經(jīng)證實被偶聯(lián)后的干擾素,生物學(xué)活性大部分得以保留,同時免疫應(yīng)答極大地降低,血清半衰期也極大地得到了延長。

        動物α型干擾素對畜禽病毒性疾病具有較好的防治效果。安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室采用基因工程技術(shù)克隆并表達(dá)了豬α型干擾素,并將實驗室合格產(chǎn)品制成凍干粉針劑發(fā)送至安徽省多家養(yǎng)豬場進(jìn)行臨床試驗。結(jié)果證明,該室研制的重組豬α干擾素能有效治療豬病毒性疾病。對治療豬病毒性腹瀉有效率為83.5%,治愈率為63.9%。在該項目的基礎(chǔ)上,對重組豬α干擾素進(jìn)行聚乙二醇化修飾,以獲得長效制劑,從而延長藥物在體內(nèi)循環(huán)半衰期、減少體內(nèi)清除率,減少給藥次數(shù)、降低動物的應(yīng)激性、增強(qiáng)療效、降低用藥成本。作為新型獸藥的開發(fā)這一項目有重要的學(xué)術(shù)價值和應(yīng)用前景,同時具有較高的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

        本研究采用分子量大、反應(yīng)條件溫和的20 kΔ單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(μ∏EΓ-∑X)修飾劑對重組豬α干擾素進(jìn)行了修飾(圖1),并通過控制反應(yīng)條件,期望獲得半衰期更長、更穩(wěn)定,且體外活性保留較高的∏E?;亟M豬α干擾素產(chǎn)物。且對該單修飾產(chǎn)物進(jìn)行了純度、體外抗病毒活性進(jìn)行了檢測,為進(jìn)一步考察其藥代動力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        原料:單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEG-SC),重組豬α干擾素。

        儀器:Amersham Pharmacia公司的AKT A Explorer 色譜系統(tǒng);北京六一儀器廠的DYY-Ⅲ -4穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。

        試劑:牛血清白蛋白;甲叉丙烯酰胺; 丙烯酰胺、SDS;考馬斯亮藍(lán)R250; RRMI 1640培養(yǎng)基;小牛血清; 其余試劑均為國產(chǎn)分析純或生化純試劑。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 聚乙二醇-重組豬α干擾素的制備與純化 干擾素用5 mmol/L pH3.0~5.0的磷酸二氫鉀緩沖液稀釋到0.1 mg/mL;加入計算量的干擾素,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到8.0,按干擾素:mPEG為1∶20的物質(zhì)的量加入1/4量的mPEG-SC,在0~4 ℃條件下反應(yīng),隨后每間隔2 h加入1/4量的mPEG-SC,加入完畢后繼續(xù)反應(yīng)4 h,加入0.75 mol/L的甘氨酸1 mL終止反應(yīng);隨后將上述反應(yīng)液用5倍量體積、濃度為50 mmol/L pH 7.2的醋酸鈉緩沖液稀釋,然后上Superdex 75 Highload制備型凝膠色譜柱(26 mm×600 mm, 22~24μm),以5倍體積pH 7.2的醋酸鈉緩沖液洗柱后,用含0.5 mol/L NaCl的醋酸鈉緩沖液洗脫,收集含PEG-干擾素的洗脫液,濃縮,SDS-PAGE電泳檢測。用Superdex 200對“(1)”中得到PEG化干擾素進(jìn)一步純化,洗脫液為pH 7.2的醋酸鈉緩沖液(含0.2 mol/L NaCl),用波長為280 nm的紫外吸收檢測,收集含PEG-干擾素的洗脫液,濃縮。

        1.2.2 SDS-PAGE電泳法對產(chǎn)物的檢測 對濃縮的各洗脫峰采用SDS-PAGE電泳檢測,分離膠10%,濃縮膠5%。電泳結(jié)束后,將膠體固定(固定液:30%甲醇、5%乙酸)室溫?fù)u動染色1 h(染色液:0.05%考馬斯亮藍(lán)、30%甲醇、5%乙酸);最后將膠體移入脫色液(脫色液:1%戊二醛、30%甲醇、5%乙酸)中室溫?fù)u動浸泡直至條帶清晰為止。

        1.2.3 蛋白濃度的測定 以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn),按Lowry法[3]測定濃縮后的蛋白濃度。

        1.2.4 抗病毒活性的測定 采用WISH-VSV系統(tǒng)檢測干擾素的抗病毒活性[4]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 聚乙二醇-重組豬α干擾素的制備與純化

        豬α干擾素的等電點在6.2左右,經(jīng)聚乙二醇修飾后,等電點有所降低,因此可采用離子交換層析的方法對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。結(jié)果如圖2所示,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明,修飾后產(chǎn)物分離組分(聚乙二醇-重組豬α干擾素)呈單一條帶,純度能夠達(dá)到97%。對條帶3反應(yīng)原液各組分經(jīng)光密度計算可知反應(yīng)修飾率能夠達(dá)到65%。

        2.2 聚乙二醇-重組豬α干擾素抗病毒活性

        對WISH細(xì)胞用不同劑量的修飾干擾素進(jìn)行處理,24 h后吸棄,再分別接種100 TCID50的VSV病毒。結(jié)果表明,聚乙二醇修飾后的重組豬α干擾素能夠明顯抑制VSV引起的細(xì)胞病變,通過效價測定(表1),所得的單修飾產(chǎn)物活性保留達(dá)到了29%。

        3 討論

        蛋白質(zhì)分子中的氧基有較高的親核反應(yīng)活性,而含有氨基的氨基酸主要有Lys和氮末端的氨基,對大部分蛋白來說,通常賴氨酸含量比較高,因而賴氨酸的氨基是最易被PEG修飾的位點[5]。?;疨EG里包括經(jīng)常使用的mPEG-SC、mPEG-SS。其中,自從90年代初開始開發(fā)mPEG-SC以來,由于其與蛋白反應(yīng)時條件溫和,應(yīng)用的最多。

        本研究采用分子量為20 000 的單mPEG-SC對重組豬α干擾素進(jìn)行了修飾。干擾素與干擾素修飾產(chǎn)物之間的主要差別之一是分子量的差異,因此本實驗采用凝膠過濾色譜分離純化聚乙二醇修飾重組豬α干擾素。這種分離模式是已經(jīng)用于工業(yè)化生產(chǎn),工藝成熟。利用該分離條件,我們成功的純化獲得聚乙二醇修飾重組豬α干擾素。此分離純化模式相對比較穩(wěn)定,回收率較為理想,一方面滿足了后續(xù)聚乙二醇修飾重組豬α干擾素性質(zhì)研究的需要,另一方面為它走向工業(yè)生產(chǎn)進(jìn)行嘗試,希望能為聚乙二醇修飾重組豬α干擾素產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)提供參考??共《净钚匝芯克玫男揎棶a(chǎn)品中IFN體外抗病毒活性隨著修飾后相對分子質(zhì)量的增加而降低,但活性保留達(dá)到了29%,仍然具有良好的抗病毒活性。

        在本研究中,實驗的反應(yīng)條件溫和可控,對氮端修飾率高,分離純化工藝簡單,收率高,可獲得高純度高均一性的樣品,確定了定點修飾干擾素的先導(dǎo)化合物,為后續(xù)開發(fā)研究工作奠定了基礎(chǔ)。

        參考文獻(xiàn):

        [1] PASUT G,VERONESE F M.State of the art in PEGylation: The great versatility achieved after forty years of research [J]. J Control Release,2012,161(2):461-472.

        [2] 趙 俊,張俊玲,李 增,等. 重組豬干擾素α1凍干粉針劑對豬的安全性試驗研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2014(1): 195-198.

        [3] 閆 萍,楊 琦,王惠珍,等. 改良Lowry法和Bradford法測定蚯蚓提取物中蛋白質(zhì)含量的比較[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006 (1):9-11.

        [4] 中華人民共和國衛(wèi)生部.中國生物制品規(guī)程. 一部[M]. 北京:中國人口出版社,1995. 268-269.

        [5] 楊 旭,貢 濟(jì). 宇蛋白多肽類藥物聚乙二醇化修飾研究進(jìn)展[J]. 中國當(dāng)代醫(yī)藥,2012,31(19):16-20.

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