劉平平?。ㄉ綎|濱州沃華生物工程有限公司　濱州　256606）許瑞利　（山東省棗莊市市中區(qū)畜牧獸醫(yī)局）

試驗(yàn)研究

一株豬鏈球菌的分離鑒定

劉平平（山東濱州沃華生物工程有限公司濱州256606）
許瑞利（山東省棗莊市市中區(qū)畜牧獸醫(yī)局）

摘要從河北某豬場送檢的一份病豬病料中分離出1株鏈球菌，革蘭氏染色表現(xiàn)為G+球菌，該菌在普通瓊脂綿羊血平板上形成圓形、乳白色、表面光滑整齊、具有溶血環(huán)的小菌落，通過對該菌進(jìn)行細(xì)菌16SRNA、PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果表明分離菌是一鏈球菌，對該分離菌株的毒力因子檢測中發(fā)現(xiàn)，其莢膜多糖CPS2J+、gdh+、sly+、epf+、mrp+均為陽性、該菌一定劑量對小白鼠有致死性，對阿莫西林、青霉素、復(fù)方新諾明比較敏感，對四環(huán)素耐藥。該結(jié)果對今后該豬場豬鏈球菌病的臨床防治具有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞鏈球菌分離鑒定

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）可以導(dǎo)致豬的急性敗血癥、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎及急性死亡［1-2］，該病主要通過傷口、消化道導(dǎo)致人的發(fā)病甚至死亡，該病原菌對外界環(huán)境抵抗力相對較強(qiáng)，在4℃到8℃冷藏豬肉中可以存活一個多月，常溫下在糞便中1周仍可存活，在眾多亞型豬鏈球菌中，2型豬鏈球菌其致病性較強(qiáng)，對人畜危害巨大［3， 4］，一旦感染發(fā)病，若治療不及時對人畜的致死率很高，典型案例是于2005年發(fā)生于四川省資陽市的豬鏈球菌疫病不僅在短時間內(nèi)使大量育肥豬死亡，經(jīng)濟(jì)上蒙受極大的損失，而且造成了多例人感染鏈球菌并致人死亡事件，因此此菌是危害我國生豬養(yǎng)殖業(yè)及人類公共衛(wèi)生的一種重要的人畜共患病病原菌［5， 6］，本試驗(yàn)從河北省某豬場一病豬病料中分離到一株2型豬鏈球菌，并對該分離菌進(jìn)行了相關(guān)毒力基因的PCR檢測、藥敏試驗(yàn)、小鼠的致病性試驗(yàn)等初步研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料河北省某豬場的疑似鏈球菌病病死豬剖檢病料。

1.1.2試劑改良馬丁肉湯、營養(yǎng)瓊脂；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自TianGen公司，PCR相關(guān)試劑均購自寶生物（大連）有限公司；抗生素藥敏紙片購自北京天壇生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌生化反應(yīng)管購自杭州天和微生物試劑有限公司；普通營養(yǎng)瓊脂綿羊血平板、按常規(guī)方法制備。

1.1.3試驗(yàn)動物昆明白小鼠20只，體重18g左右，購自山東省實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌的常規(guī)分離及生化特點(diǎn)生物安全柜內(nèi)將病料樣品用劃線接種于普通瓊脂綿羊血平板，于37℃培養(yǎng)36h后觀察其菌落特點(diǎn)，挑取疑似鏈球菌菌落染色、鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)。將分離菌株分別接種于各個細(xì)菌生化微量反應(yīng)管， 37℃培養(yǎng)條件下觀察生化反應(yīng)特點(diǎn)。

1.2.2玻片凝集試驗(yàn)將疑似菌落接種改良馬丁肉湯，于37℃培養(yǎng)12h，取0.5ml培養(yǎng)物，經(jīng)5000r/min離心2min，棄上清，用70μl的無菌pbs懸浮沉淀，取20μl菌體懸浮液分別與等體積的無菌pbs、豬鏈球菌2型陽性血清做玻片凝集試驗(yàn)，其中無菌pbs作為陰性對照并觀察陰性對照是否成立。

1.2.3豬鏈球菌的PCR鑒定及毒力因子檢測取細(xì)菌培養(yǎng)物1 ml離心取沉淀，使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA備用，細(xì)菌16S RNA通用引物為本實(shí)驗(yàn)室保存、鏈球菌毒力因子鑒定參照文獻(xiàn)［7-10］及NCBI上部分基因序列，相關(guān)引物由生工生物工程上海有限公司合成見表1，細(xì)菌16S RNA擴(kuò)增PCR產(chǎn)物送生工測序。（1）細(xì)菌16S RNA擴(kuò)增條件為：Taq酶0.5μl、10×PCR Buffer 5μl、dNTP Mixture 4μl、16S rDNA上下游引物各1μl、提取模板1μl，加無菌水至50μl，分型擴(kuò)增參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃退火50s，72℃延伸80s，30個循環(huán)，最后72℃延伸8min。（2）豬鏈球菌毒力因子2型莢膜多糖CPS2J加樣體系為：Taq酶0.5μl、10×PCR Buffer 5μl、dNTP Mixture 4μl、cps2J-F、cps2J-R各1μl、提取模板1μl，加無菌水至50μl，分型擴(kuò)增參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，32個循環(huán)，最后72℃延伸8min。（3）豬源鏈球菌毒力因子溶血素基因sly PCR鑒定反應(yīng)體系為：Taq酶0.5μl、10×PCR Buffer5μl、2.5mmol/L的dNTP Mixture 5μl、sly基因上下游引物各0.5μl、模板DNA1μl、加無菌水至50μl，擴(kuò)增參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，51℃退火45s，72℃延伸45s，32個循環(huán)，最后72℃延伸8min；gdh、epf、mrp各個反應(yīng)體系同sly。

表1　引物序列及長度

1.2.4對小鼠致死性試驗(yàn)將該分離菌接種到改良馬丁肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)36h（含菌量約為2.0×108CFU/ml）。20只昆明白小鼠分成4組，每組5只，分別腹腔接種1.0×106、1.0×107及1.0×108細(xì)菌培養(yǎng)物，同時取1組小鼠作對照，腹腔接種0.5ml無菌培養(yǎng)基。腹腔注射該分離菌后小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察其發(fā)病、死亡情況。

1.2.5藥敏試驗(yàn)將分離株細(xì)菌馬丁肉湯培養(yǎng)物用滅菌PBS稀釋后均勻涂布150μl于普通瓊脂平板，搖勻后用滅菌槍頭吸出多余菌液，選取相應(yīng)抗生素阿莫西林、青霉素、紅霉素、等常用抗菌藥物，藥敏紙片輕輕放在固體平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察并判定結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌的常規(guī)分離及生化特點(diǎn)

經(jīng)37℃培養(yǎng)24h候后在普通瓊脂綿羊血平板上形成小圓形、乳白色、菌落表面光滑整齊、邊緣相對整齊的菌落、菌落周圍出現(xiàn)明顯的溶血環(huán)如圖1和圖2。染色為典型革蘭氏陽性球菌，生化試驗(yàn)表明該鏈球菌菌可以發(fā)酵乳糖、蔗糖、葡萄糖、七葉苷，不發(fā)酵山梨糖、山梨醇、甘露醇、等，VP陰性，MR檢測陽性。

圖1　分離菌劃線血平板1

圖2　分離菌劃線血平板2

2.2玻片凝集試驗(yàn)

分離株與豬鏈球菌2型陽性血清玻片凝集試驗(yàn)為陽性，陰性對照成立。

2.3豬鏈球菌PCR分型鑒定及毒力因子檢測

分離菌16SRNA擴(kuò)增見圖3，目的片段大小為1500bp，PCR產(chǎn)物測序表明該分離菌是一豬鏈球菌；毒力因子PCR檢測結(jié)果如圖4，莢膜多糖CPS2J片段大約480bp、胞外因子epf片段大約740bp、溶血素sly基因片段大約248bp、谷氨酸脫氫酶gdh片段大約為325bp、溶菌酶釋放蛋白mrp片段大約為204bp。將擴(kuò)增陽性的PCR產(chǎn)物分別回收后送生工測序，測的序列與NCBI上公布的序列比較后進(jìn)一步確定為2型豬鏈球菌。

圖3　分離菌16S RNA鑒定M1: DL15000； 2:16S RNA PCR產(chǎn)物

圖4　豬鏈球菌毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4對小鼠致死性試驗(yàn)

攻毒16h后，河北分離株1.0×106劑量死亡1只、1.0× 107攻毒組死亡4只，1.0×108全部死亡，空白對照組5只小白鼠全部健在，由此可見此分離菌在1.0×107劑量對小鼠有致死性。

2.5藥敏試驗(yàn)

分離菌株對阿莫西林、青霉素、復(fù)方新諾明、紅霉素、卡那霉素等抗菌藥中度敏感，對四環(huán)素耐藥。

3　討論

本試驗(yàn)分離到的豬鏈球菌是從脾臟中分離到的，病豬死前呈典型的豬鏈球菌病癥狀，在毒力因子的PCR檢測中發(fā)現(xiàn)該鏈球菌分離株的溶血素基因sly、胞外因子ef及溶菌酶釋放蛋白mrp三個毒力因子均為陽性，且小白鼠致病性試驗(yàn)表明此分離菌具有一定的毒力，藥敏試驗(yàn)表明該分離株對青霉素、復(fù)方新諾明、紅霉素等抗菌藥敏感，在治療時選擇這些抗生素取得的治療效果較好，此菌的分離鑒定為自家滅活菌苗的制備提供了候選菌株，為今后該豬場豬鏈球菌病的防治提供了一定的參考價值。

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中圖分類號：S852.61+1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-1733（2015）04-0001-03

收稿日期：（2015-01-19）