王鑫，徐麗萍，王派麗

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076）

陰離子交換樹脂法純化透明質(zhì)酸工藝的研究

王鑫，徐麗萍*，王派麗

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076）

以雞冠中提取的透明質(zhì)酸（HA）粗提物為原料，通過靜態(tài)吸附及解析試驗(yàn)確定選用201×7型陰離子交換樹脂，通過動(dòng)態(tài)吸附及解析實(shí)驗(yàn)，確定透明質(zhì)酸最佳純化條件為：HA粗提物與樹脂體積比為4∶1；吸附時(shí)間為45 min；洗脫劑濃度為0.6 mol/L NaCl溶液；洗脫流速為1.0 mL/min；洗脫劑用量與樹脂體積比為4∶1。對(duì)純化后的物質(zhì)進(jìn)行紫外光譜檢測(cè)，結(jié)果表明純化后物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品峰型一致，證明純化后物質(zhì)為透明質(zhì)酸；粗提物的純化率為26%，純化物的純化率為89.43%，顯著提高了透明質(zhì)酸的純化率。

透明質(zhì)酸；陰離子交換樹脂；純化

透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）是一種廣泛存在于魷魚眼、雞冠、臍帶等結(jié)締組織基質(zhì)中由N-乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡糖糖醛酸交替聚合而成的高分子粘多糖[1]。因?yàn)镠A具有較高的保濕性、粘彈性、滲透性及生物相容性，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)及化妝品中[2]。HA還可以滲入真皮組織促進(jìn)血液循環(huán)、改善組織中間代謝和營養(yǎng)供應(yīng)，在皮膚中發(fā)揮保水、維持細(xì)胞外空間、參與角蛋白細(xì)胞變化、受體結(jié)合以及清除自由基作用，由于HA分布于體內(nèi)所有組織，含量較高的有關(guān)節(jié)腔、眼及皮膚等，若出現(xiàn)HA減少則導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、老花眼、皮膚出現(xiàn)皺紋等[3-5]。因此，HA保健食品受到越來越多人的重視和接受，因?yàn)榭诜﨟A保健品是全身性作用，可由人體吸收，由真皮至表皮增加內(nèi)源性HA的含量，使細(xì)胞活化，發(fā)揮全身作用，與化妝品局部使用具有明顯的不同。真皮基質(zhì)主要由膠原蛋白和HA等粘多糖組成，皮膚老化由于膠原蛋白產(chǎn)生變化所致，而膠原蛋白的改變是由于HA的減少所致[6-7]。因此，維持膠原蛋白的功能就必須補(bǔ)充HA?？诜﨟A可補(bǔ)充體內(nèi)HA的不足，預(yù)防組織和細(xì)胞老化，特別是維持老年人的健康具有特殊的功能。因此對(duì)HA的純度要求較高，對(duì)HA的純度研究受到日益廣泛的關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

雞冠：哈爾濱南極市場(chǎng)；201×7陰離子交換樹脂、D218陰離子交換樹脂、D301陰離子交換樹脂：沈陽市心西試劑廠；HA標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；鹽酸：哈爾濱市化工試劑廠；氯化鈉：天津市北方醫(yī)化學(xué)試劑廠。

紫外可見分光光度計(jì)TU-1900型：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器R-205型：上海申勝生物技術(shù)有限公司；電子分析天平ALC-11002型：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)（DHG-9123A型）：上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雞冠中HA粗提液的制備

新鮮雞冠，用乙醇溶液浸泡24 h至雞冠變硬，置于瓷盤中于干燥箱，干燥后粉碎。將粉狀物倒入燒杯中，按其質(zhì)量加入6倍～7倍蒸餾水，攪拌均勻，靜置浸泡過夜，收集濾液，將濾液不斷攪拌加入10%的固體氯化鈉，完全溶解后，加入等體積的氯仿、正丁醇溶液（氯仿：正丁醇為4∶1），攪拌3 h左右，采用分液漏斗分層取上層水相，取20 mL上層水相于燒杯中，加入90%乙醇溶液，按照1∶2體積比的例將二者混合靜置沉淀24 h，回收乙醇溶液，沉淀物干燥后即為HA粗品，將其溶于蒸餾水中即為HA粗液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品濃度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.025 0 g經(jīng)105℃干燥至恒重的HA標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，水溶解定容。分別量取HA標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，得到一系列濃度的HA標(biāo)準(zhǔn)溶液。以蒸餾水為空白，在198 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度A。以吸光度為縱坐標(biāo)，HA濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算HA濃度，計(jì)算出HA的含量。

1.2.3 樹脂的預(yù)處理

將樹脂浸泡在2倍體積10%的乙醇溶液中24 h，用去離子水洗至中性，用6.0 mol/L鹽酸溶液浸泡24 h，去離子水洗至中性，用10%的鹽酸溶液以2 BV/h流速通過樹脂層，去離子水洗至中性備用。

1.2.4 樹脂的篩選

1.2.4.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的10 g 201×7、D218、D301陰離子樹脂，加入10 mL的HA提取液，于25℃振蕩24 h（振蕩頻率110 r/min），充分吸附后過濾，計(jì)算濾液中HA濃度，并按下式算出樹脂的吸附率：吸附率=

式中：C0為吸附前溶液的濃度，（mg/mL）；Ce為吸附后溶液濃度，（g/L）。

1.2.4.2 靜態(tài)解析實(shí)驗(yàn)

將已吸附的樹脂過濾抽干，加0.5 mol/L的NaC1溶液50 mL于樹脂中，室溫下連續(xù)振蕩24 h，收集解析液，測(cè)定濾液中HA濃度，根據(jù)下式計(jì)算樹脂對(duì)HA的解析率：

式中：C1為解吸后溶液濃度，（mg/mL）；V1為解吸后溶液體積，mL；C0為吸附前溶液濃度，（mg/mL）；Ce為吸附后溶液濃度，（mg/mL）；V為吸附液體積，mL。

1.2.5 樹脂對(duì)HA的動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

將處理好的樹脂濕法裝入內(nèi)徑為2 cm，長(zhǎng)為60 cm的樹脂柱后，加入一定量的HA粗提液，調(diào)節(jié)流速，吸附一定時(shí)間后，測(cè)定流出液的HA濃度，計(jì)算吸附率。再加入一定濃度的NaCl作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測(cè)定HA濃度以確定回收率。

1.2.6 紫外分光光度法檢測(cè)HA

將HA標(biāo)準(zhǔn)品與純化樣品在波長(zhǎng)190 nm～600 nm范圍內(nèi)掃描，比較標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的出峰位置及峰形。

2 結(jié)果與討論

2.1 HA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與分析

HA標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 HA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of hyaluronic acid

由圖1可知標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=1.457 1x-0.007 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3，在HA濃度為0.000 0～0.300 0 g/L的范圍內(nèi)HA濃度與吸光度之間有良好的線性關(guān)系。

2.2 樹脂篩選結(jié)果分析

選擇3種類型的陰離子樹脂進(jìn)行篩選，確定HA最佳純化樹脂，樹脂篩選結(jié)果見表1。

由表1可知，在相同條件下201×7樹脂對(duì)HA有較高的吸附量和解析率，故選擇201×7樹脂進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 陰離子樹脂篩選結(jié)果分析表Table 1Screen results of anion resin

2.3 HA的最佳上樣量的選擇

選擇201×7樹脂進(jìn)行HA純化，考察上樣量對(duì)吸附率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 HA粗提物上樣量對(duì)吸附率的影響Fig.2 Influence of HA crude extract on the adsorption rate

由圖2所示，流出液中HA的含量隨著上樣量的增加而增加，上樣量在1∶1到3∶1之間上升緩慢，此階段為吸附過程，上樣量超過3∶1后吸附透過曲線徒然上增飽和點(diǎn)為4∶1，此時(shí)樹脂柱完全吸附飽和，之后隨著上樣量的增加吸附曲線呈下降趨勢(shì)，因?yàn)榇藭r(shí)的HA有部分損失，使相互作用的范德華力減少。因此，為了減少泄露，在增大HA得率的同時(shí)增加上樣量，最佳比值為HA粗提物與樹脂比值為4∶1。

2.4 HA最佳吸附時(shí)間的選擇

將HA粗提物與樹脂比值確定為4∶1，考察吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響Fig.3 Influence of eluent time on the adsorption rate

如圖3所示，靜置時(shí)間為30 min～45 min時(shí)曲線呈上升趨勢(shì)，靜置45 min時(shí)解吸率達(dá)到最大值，而后曲線呈下降趨勢(shì)。時(shí)間過短吸附不完全，HA成分隨之流出，因而吸附率較低。而時(shí)間過長(zhǎng)又將難以吸附。原因是吸附是以物理吸附為主、伴隨化學(xué)吸附的過程，此過程進(jìn)行的較慢，當(dāng)時(shí)間45 min時(shí)吸附即達(dá)到平衡。為節(jié)省時(shí)間，選取靜置時(shí)間45 min為吸附最佳時(shí)間。2.5HA的洗脫劑最佳濃度的選擇

將HA粗提物與樹脂比值確定為4∶1，吸附時(shí)間45 min，考察洗脫劑濃度對(duì)解析率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 洗脫劑濃度對(duì)解析率的影響Fig.4 Influence of eluent concentration on the adsorption rate

如圖4所示，當(dāng)NaCl溶液濃度為從0.3 mol/L升至0.6 mol/L時(shí)，洗脫液中HA含量升高并達(dá)到最大；當(dāng)NaCl溶液濃度高于0.6 mol/L時(shí)，隨著NaCl溶液濃度的增大而降低。由于高濃度的洗脫液中的陽離子中和了樹脂中的陰離子使呈酸性的HA大量洗脫出來，但是在洗脫劑濃度為0.6 mol/L時(shí)達(dá)到飽和狀態(tài)，因此再增加洗脫劑濃度反而使多余的陽離子中和了HA的酸性基團(tuán)導(dǎo)致洗脫出的HA得率下降，因此確定HA純化最佳洗脫濃度為0.6 mol/L。

2.6 HA的洗脫劑最佳流速的確定

將HA粗提物與樹脂比值確定為4∶1，吸附時(shí)間45 min，洗脫劑NaCl溶液濃度為0.6 mol/L，考察洗脫流速對(duì)解析率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 洗脫劑流速對(duì)解析率的影響Fig.5 Influence of eluent speed on the adsorption rate

如圖5所示，洗脫劑洗脫流速由0.5 mL/min到1.0 mL/min時(shí)，HA解析率增長(zhǎng)緩慢；當(dāng)洗脫劑流速超過1.0 mL/min時(shí)，HA解析率下降并下降較快；由于以較低流速通過樹脂時(shí)與HA提取液有充足的接觸時(shí)間，使HA充分的解析出來，但是隨著流速的增加通過速度加快，導(dǎo)致部分洗脫劑未與HA提取液充分接觸即流出樹脂柱導(dǎo)致HA的解析率下降，離子交換過程中必須使固液兩相有充分的接觸時(shí)間，如果液相流速增加，固液接觸時(shí)間縮短，樹脂與上樣液就來不及交換，較快的流速不利于吸附的進(jìn)行，理論上講流速越慢吸附進(jìn)行的越完全。為了進(jìn)行有效的交換故應(yīng)采用較低的流速。但過慢會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，從而提高成本。因此，綜合考慮，洗脫劑流速在1.0 mL/min時(shí)為最佳洗脫流速。

2.7 HA的洗脫劑最佳用量的確定

將HA粗提物與樹脂比值確定為4∶1，吸附時(shí)間45min，洗脫劑NaCl溶液濃度為0.6 mol/L，洗脫流速為1.0 mL/min，考察洗脫劑用量對(duì)解析率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 洗脫劑用量對(duì)解析率的影響Fig.6 Influence of eluent dosage on the adsorption rate

如圖6所示，當(dāng)NaCl溶液用量與樹脂體積比為由1∶1升至1∶2時(shí)呈明顯上升趨勢(shì)，由1∶2升至1∶3時(shí)增長(zhǎng)速度緩慢但達(dá)到最大值得到最高的HA的解析率，繼續(xù)增加二者比值，HA的解析率逐漸下降，由于洗脫劑為流動(dòng)相，是攜帶被測(cè)的HA流出的載體，洗脫劑用量較小時(shí)只有部分HA被帶出，導(dǎo)致部分流失，而在洗脫劑與樹脂體積比達(dá)到4∶1時(shí)所通過的HA粗提液中的HA被全部帶出，得到最優(yōu)的解析率，因此確定HA純化洗脫劑NaCl溶液用量與樹脂體積比為4∶1。

采用最佳工藝條件純化HA，雞冠中HA的純化率為89.43%。

2.8 紫外分光光度法分析HA的結(jié)果

紫外分光光度法分析HA的結(jié)果見圖7。

由圖7可見，樣品與標(biāo)品的出峰位置及峰形一致，可確定本實(shí)驗(yàn)純化物質(zhì)為HA。

圖7 HA標(biāo)準(zhǔn)品和樣品吸收光譜Fig.7 Absorption spectrum of the HA standards and samples

3 結(jié)論

采用離子交換樹脂法對(duì)提取的HA進(jìn)行純化。并對(duì)純化后的HA進(jìn)行了定性定量研究。通過對(duì)HA靜態(tài)吸附及解吸試驗(yàn)，確定201×7陰離子交換樹脂為最佳純化樹脂。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了樹脂純化HA的最佳條件為：HA粗提物與樹脂體積比為4∶1；吸附時(shí)間為45 min；洗脫劑為0.6 mol/L NaCl溶液；洗脫流速為1.0 mL/min；洗脫劑用量與樹脂體積比為4∶1。純化后HA的純化率為89.43%。對(duì)純化后的物質(zhì)進(jìn)行紫外光譜法檢測(cè)，結(jié)果表明純化后物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品峰值位置一致，確定純化后的物質(zhì)為HA。

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Purification Technology of Hyaluronic from Acid with Anion Exchange Resin

WANG xin，XU Li-ping*，WANG Pai-li
（Key Laboratory of Food Science and Engineering，School of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，Heilongjiang，China）

The hyaluronic acid extracted crude extract used as raw material.Through static adsorption and resolution test determine to use 201×7 anion exchange resin，By dynamic adsorption and analytical experiments，the best purification conditions of hyaluronic acid were determined as follows：liquid dosage and resin adsorption volume ratio of 4∶1；the adsorption time is 45 min；the concentration of eluent is 0.6 mol/L sodium chloride solution；the speed of elution is 1.0 mL/min；dosage of eluent and resin volume ratio of 4∶1.Through ultraviolet spectrometry detection to test substance of ion exchange resin after purification，the results showed that the purified substance and the standard peak position is consistent，proof the substance after purified was hyaluronic acid；the purification rate of crude extract was 26%，the purification of the purification rate was 89.43%，the purification rate of hyaluronic acid was improved significantly.

hyaluronic acid；anion exchange chromatography；purification

2014-02-08

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.011

哈爾濱商業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201310240092）

王鑫（1984—），女（漢），講師，在讀博士，研究方向：食品質(zhì)量與安全、農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。

*通信作者