吳彤華，成金泉，朱元昌，黃菊，馬珍珍，尹彪，曾勇＊，蔡應木

（1.汕頭大學醫(yī)學院，汕頭 515041；2.深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，深圳 518045；3.深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045；4.深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳 518045；5.汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，汕頭 515041）

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥是人類最常見的酶缺陷病之一，全球約4億人受累［1］，我國南方是高發(fā)區(qū)之一。該病為X 連鎖不完全顯性遺傳，臨床表現(xiàn)具有高度異質性，發(fā)病的主要表現(xiàn)為溶血性貧血和由此而產生的以未結合膽紅素升高為特點的高膽紅素血癥，成年患者最嚴重的威脅是出現(xiàn)急性腎衰竭，而新生兒期發(fā)病則可導致核黃疸，造成永久性神經系統(tǒng)損傷甚至死亡，是聯(lián)合國衛(wèi)生組織6種主要應該預防和控制的遺傳病之一，亦是廣東省及深圳市出生缺陷干預工程的干預病種之一。

植入前遺傳學診斷（PGD）是在胚胎植入子宮前進行的最早期的產前診斷。性連鎖遺傳性疾病既往一般通過PGD 性別選擇來避免有表型的患者出生，但只有針對致病基因進行檢測才能最為有效地阻斷垂直傳播，實現(xiàn)優(yōu)生目的。隨著越來越多的特異性診斷技術用于PGD，近年性連鎖遺傳性疾病進行特異性植入前遺傳學診斷的比例逐漸增加［2］，但目前仍較少有針對G6PD 基因進行PGD 的報道，故建立準確的單細胞G6PD 基因診斷技術意義深遠。多重SNaPshot技術是近年分子遺傳學領域用于分析已知單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點的先進技術，其結合了PCR 技術和熒光光譜技術的優(yōu)勢，具有快速、高靈敏度、高準確度、高通量等特點［3］，使其應用到PGD 成為可能。本研究擬采用巢式PCR 對深圳不孕癥人群G6PD 基因突變高發(fā)的外顯子2、9、11、12［4］進行擴增，通過多重SNaPshot技術對12個突變位點同時進行基因分型，探討臨床開展G6PD 缺乏癥PGD 工作的可行性。

材料與方法

一、細胞來源

根據深圳地區(qū)不孕人群G6PD 基因突變頻率的高低次序［4］，選取最常見的3 種突變類型的G6PD缺乏癥女性患者和正常女性各1 例（共4 例），抽取其外周靜脈血，并經測序方法再次確認其G6PD 基因型。

二、實驗方法

1.單細胞模板制備：抽取外周靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝，用淋巴細胞分離液（上海恒信化學試劑）通過密度梯度離心法分離得到外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），經洗滌液（含10g／L 人血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液）洗滌后制成PBMC 懸液，在倒置顯微鏡下吸取單個淋巴細胞，依次移入3 個洗滌液微滴中吸洗。將洗滌3次后的單個淋巴細胞轉入含5μl堿性裂解液［200mmol／L KOH，50mmol／L DTT（Sigma-Aldrich，美國）］的0.2ml滅菌薄壁PCR 反應管中，同時取最后一次洗滌該單個細胞的洗滌液移入另一含5μl堿性裂解液的PCR 反應管中作為陰性對照。65 ℃加熱10min裂解細胞后加入5μl中和液［200 mmol／L tricine（Sigma-Aldrich，美國）］。

2.引物設計合成：巢式PCR 引物和多重SNaPshot延伸引物設計采用Primer3 在線引物設計軟件完成，由上海生物工程公司合成，序列見表1。

3.巢式PCR：（1）單管多重外側擴增反應總體積為50μl，內含1×Hot Start Taq PCR 緩沖液，1.5 mmol／L Mg2＋，0.2 mmol／L dNTP，Exon 2 OUT F／R 和Exon 9-13OUT F／R 各0.2μmol／L，1U Maxima Hot Start Taq酶（Fermentas，德國）和10μl裂解模板液。熱循環(huán)參數(shù)：96 ℃預變性5 min；94 ℃30s，56 ℃30s，72 ℃90s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸7min。（2）內側擴增反應分Exon 2IN、Exon 9IN 和Exon 11-12IN 三管獨立擴增，每管總體積為50μl，內含1×Hot Start Taq PCR 緩沖液，1.5 mmol／L Mg2＋，0.2 mmol／L dNTP，相 應 的Exon IN F／R 0.2μmol／L，1U Maxima Hot Start Taq酶（Fermentas，德國）和3μl外側擴增產物。熱循環(huán)參數(shù)：94 ℃預變性5min；94 ℃30s，（Exon 2 IN 為52 ℃，Exon 9IN 為60 ℃，Exon 11-12IN 為56 ℃）30s，72℃60s，35個循環(huán)；72℃延伸7min。（3）內側擴增PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果并記錄。（4）使用QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen，德國）按說明書要求進行內側擴增產物純化。

4.單管12重SNaPshot基因分型：（1）延伸反應總體系為10μl，包括純化后產物3μl、無核酸酶的去 離 子 水3.25 μl、5×Seq 緩 沖 液1.5 μl、SNaPshot?Multiplex Mix（Applied Biosystems，美國）1.25μl、5μmol／L SNaPshot引物混合物（95、871、1004、1024、1311、1360、1376、1381、1387、1388、1414和IVS-1193）1μl。熱循環(huán)參數(shù)：96 ℃10s，50 ℃5s，60 ℃30s，25 個循環(huán)。（2）10μl延伸產物中加入1USAP（Takara，日本）經37 ℃60min，75 ℃15 min 進行純化。（3）每反應體系中加入Hi-DiTMFormamide（Applied Biosystems，美 國）9μl、GeneScanTM-120LizTMSize Standard（Applied Biosystems，美國）0.5μl和已純化延伸產物1μl，95 ℃變性5 min，立即置于冰上5 min 后于AB 3500遺傳分析儀（Applied Biosystems，美國）進行毛細管電泳。應用GeneMapper V4.1軟件進行數(shù)據分析，根據SNaPshot產物中各峰的位置確定該延伸產物對應的突變位點，根據峰的顏色可知摻入的堿基種類（綠色為A、藍色為G、黑色為C、紅色為T）。只在某個突變位點對應的峰位置出現(xiàn)野生型顏色的峰則表明該位點為野生型；只出現(xiàn)突變型顏色的峰則表明基因型為純合突變型或半合子；同時出現(xiàn)野生型和突變型顏色的峰則表明該基因型為雜合突變。兩個或以上位點出現(xiàn)突變型顏色的峰表明存在復合突變。

結 果

共獲得166 個單淋巴細胞（58 個為正常基因型，108個為G6PD 基因突變雜合子），其中151個細胞（52個正常，99個雜合子）擴增成功，擴增效率為90.97%（151／166）。

成功擴增的99個雜合子單淋巴細胞中有8個細胞在基因分型時在相應突變位點處僅見單峰而未觀察到雜合雙峰，表明PCR 過程中發(fā)生等位基因脫扣（allele drop out，ADO）現(xiàn)象，ADO發(fā)生率為8.08%（8／99）。

各類淋巴細胞實驗結果見表2。

166例陰性對照均未發(fā)現(xiàn)陽性擴增。內側擴增反應PCR 產物瓊脂糖電泳結果見圖1。正常單細胞檢測G6PD 基因12 個突變位點的峰位置和野生型的峰顏色詳見圖2。各突變雜合子及其野生型等位基因發(fā)生脫扣的SNaPshot圖譜見圖3；各突變雜合子突變型等位基因發(fā)生脫扣的SNaPshot圖譜和正常樣本相同。

圖1 內側擴增反應PCR 產物2%瓊脂糖電泳圖

表2 單個淋巴細胞分析結果

圖2 正常單淋巴細胞G6PD 基因12 個突變位點SNaPshot分型圖譜

圖3 雜合子及其野生型等位基因發(fā)生脫扣的SNaPshot分型圖譜

討 論

G6PD 缺乏癥屬于遺傳性疾病，目前尚無有效的根治方法，重在預防。通過對G6PD 缺乏癥患者進行遺傳咨詢、產前診斷，對子代進行有效預防與及時處理，可減輕本病對新生兒的危害，降低新生兒出生缺陷率，達到優(yōu)生優(yōu)育、提高出生人口質量的目的。PGD 是輔助生殖技術與遺傳學診斷技術相結合的產物，將對遺傳疾病診斷的時機提前到胚胎發(fā)育的最早階段，選擇正常胚胎植入母體子宮，從而阻斷單基因疾病及染色體異常的患兒出生，這樣既可避免遺傳病的垂直傳播，又可以避免流產和治療性引產給夫婦雙方帶來的身體和精神上的創(chuàng)傷，已成為一個更易為人們所接受的產前診斷技術［5］。

G6PD 缺乏癥作為一種全球高發(fā)病率的單基因遺傳病，既往一般通過性別選擇以避免有表型的患兒出生，但存在以下問題：（1）若父方正常、母方為致病基因的雜合子，生育后代時無論男女都有可能攜帶致病基因，以往通過PGD 選擇女性胚胎移植的做法存在重大缺陷：①淘汰的男性胚胎中有50%可能為正?；?，造成了正常胚胎的浪費；②女性胚胎中有50%為雜合子，致病基因還可能遺傳給下一代，并未能從根本上切斷致病基因的遺傳；③國內外報道均早已證實女性雜合子個體可發(fā)?。?-7］，且雜合子是新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的獨立危險因素之一［8］。（2）若父母雙方均攜帶G6PD基因突變，其后代無論性別均有50%為G6PD 缺乏癥患者，行性別選擇不能避免該類患者的出生。對于這些情況，須通過G6PD 基因診斷才能確診胚胎是否正常。

G6PD 缺乏癥的分子基礎為基因突變，全球已報道突變類型超過180 多種，其中8.0%為復合突變［9］，中國人群已發(fā)現(xiàn)28種突變［10］。β地中海貧血的分子基礎亦是多種類型的基因突變，目前其PGD方法主要是反向斑點雜交［11］，該方法可同時檢測多個突變位點，但存在如操作繁瑣、耗時長，探針設計難度大，膜條制備及雜交過程中易產生非特異雜交信號而影響結果判讀等缺點。SNaPshot技術即單核苷酸延伸法，又稱微測序法，是以Sanger雙脫氧鏈終止法原理為基礎，以擴增出含SNPs位點的PCR 產物為模板，在緊鄰SNPs位點的上游或下游設計引物，四種雙脫氧核苷酸分別標記不同顏色的熒光染料，在DNA 聚合酶作用下，引物延伸一個堿基即終止，經毛細管電泳后進行片段分析，相當于單個位點的微測序，檢測單核苷酸的突變：延伸位點堿基的類型決定電泳峰的顏色，延伸引物的片段長度決定峰的位置。通過設計不同長度的引物可實現(xiàn)多個已知SNP位點同時檢測，且不管SNP位點是G／C、A／T、G／A、C／T，還是插入／缺失多態(tài)，都可以放在一個體系中檢測。另外，熒光檢測最突出的優(yōu)點是敏感性極高，等位基因檢測的信號只有另一個等位基因的1%甚至更少時，都能檢測出來，從而減少ADO 現(xiàn)象引起的誤診。微測序技術因其高靈敏度、可自動化、結果容易判讀等優(yōu)勢，已逐步被應用到多種遺傳病的PGD 中［12］。

我們已成功運用多重SNaPshot 技術建立G6PD 缺乏癥基因診斷方法［13］，在此基礎上結合巢式PCR 擴增G6PD 基因突變高發(fā)的外顯子，成功實現(xiàn)單細胞水平上對G6PD 基因12個突變位點的檢測，擴增效率為90.97%，符合歐洲人類生殖與胚胎醫(yī)學會（ESHRE）對PGD 的擴增效率不低于90%的 要求［14］。該SNaPshot法G6PD 缺 乏 癥PGD 體系從裂解細胞到獲得最終診斷結果全程僅需7h，滿足無論卵裂期還是囊胚期胚胎活檢都能進行新鮮胚胎移植的時效性要求，無需像運用全基因組擴增或反向點雜交等方法進行囊胚期PGD 時因有過夜的實驗流程而凍融胚胎，有效避免對活檢后胚胎進一步的不必要損傷。為了解該多重SNaPshot PGD體系的可靠性，本研究根據深圳地區(qū)不孕人群G6PD 基因突變頻率的高低次序［4］，選取了最常見的3種突變類型的雜合子進行單淋巴細胞G6PD 基因突變檢測，證實該體系可以檢出這幾種突變類型，ADO發(fā)生率為8.08%，滿足ESHRE 關于PGD 的ADO 率 低 于10%的 要 求［14］。另 外，該 方 法 檢 測G6PD 基因突變高發(fā)的Exon 2、Exon 9、Exon 11和Exon 12四個外顯子上共12 個突變位點，但實際G6PD缺乏癥PGD工作中無需全部檢測，可根據夫婦雙方已確診的G6PD基因型，僅針對發(fā)生突變的位點擴增其所在的外顯子并進行微測序，節(jié)約試劑成本。

本研究建立的單細胞G6PD 基因診斷方法除具有上述優(yōu)勢外，還因應用SNaPshot技術具有以下優(yōu)點：（1）結果清晰直觀，易于判讀及分析，峰的位置對應突變的位點，峰的顏色對應堿基種類；（2）對擴增產物進行各位點的微測序，準確性及特異性與金標準測序法相當；（3）等位基因選擇性擴增是單細胞PCR 特有現(xiàn)象之一，SNaPshot方法檢測的是熒光信號，靈敏度高，可有效減少弱擴增的等位基因漏檢，降低ADO 發(fā)生率；（4）成本低廉，約為50元／標本，且可通過選擇購買大包裝試劑或使用更小的反應體系令成本進一步下降；（5）操作簡單、快捷、自動化程度高；（6）鑒于實驗過程中如果PCR 擴增產物純化不夠可能會影響檢測結果［13］，對于內側擴增產物本研究改用柱純化取代傳統(tǒng)SNaPshot技術選用的SAP 及Exon I酶純化，有效避免酶質量批間差異對純化效果的影響并縮短實驗時間，更好地保證結果的準確性和時效性。

本方法亦存在不足之處：（1）G6PD 基因突變遍及除Exon 1 外所有的外顯子［1］，但本研究建立的PGD 方法僅針對突變高發(fā)的Exon 2、Exon 9、Exon 11和Exon 12四個外顯子，在中國和深圳人群中分別約有7%［15］和2%［4］的G6PD 缺 乏癥患者其基 因突變是在其余外顯子上，該小部分患者暫不能通過該方法進行PGD，這也是本課題組后續(xù)研究的內容。（2）結果檢測需要特殊設備，遺傳分析儀較為昂貴。但α 地中海貧血PGD 亦使用相同的儀器平臺［16］，故在具PGD 資質的生殖中心該儀器的普及率相對較高，不會對該方法的應用推廣造成太大的影響。

本實驗通過多重巢式PCR 和SNaPshot微測序技術，在單細胞水平上同時擴增4個G6PD 基因突變高發(fā)外顯子，一次實驗即可快速、準確地實現(xiàn)12個突變位點檢測，該法有望被具有PGD 資質的生殖中心采用，取代傳統(tǒng)的性別選擇，實現(xiàn)對G6PD缺乏癥患者真正意義上的植入前遺傳學診斷。

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