姚鳳霞，張為民＊，施惠平，邱正慶，孟巖，黃尚志

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院1.臨床遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2.兒科，北京 100730；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳室，北京 100005）

黏多糖貯積癥Ⅱ型（mucopolysaccharidosesⅡ，MPS Ⅱ，OMIM 309900），又稱Hunter綜合征，是一種罕見的X 連鎖隱性遺傳性溶酶體貯積癥（lysosomal storage disorder，LSD）。1917年由加拿大的Hunter 醫(yī) 生 首 先 報(bào) 道［1］，國 外 統(tǒng) 計(jì) 發(fā) 病 率 為1∶100 000～1∶170 000 活產(chǎn)男嬰，臺(tái)灣地區(qū)為2.05∶100 000 活產(chǎn)男嬰。據(jù)北京協(xié)和醫(yī)院兒科遺傳咨詢門診20多年來LSD 的研究發(fā)現(xiàn)，我國MPS（共7型）中約半數(shù)患者為MPS Ⅱ（未發(fā)表資料），而白種人則以黏多糖貯積癥Ⅰ型（MPS I，Hurler綜合征）為最常見。

MPS Ⅱ臨床上分為重型和輕型，重型表現(xiàn)為進(jìn)行性智力低下、骨骼異常、關(guān)節(jié)僵硬、面容丑陋等，多數(shù)患者15歲之前因呼吸道感染或心力衰竭而死亡；輕型臨床表現(xiàn)輕，智力損傷較輕，一般可存活至成年，且有生育能力。目前報(bào)道重型的發(fā)生率高于輕型。MPS II是由于患者缺乏艾杜糖-2-硫酸酯酶（iduronate-2-sulphate sulphatase，IDS），造 成 糖 胺多糖（glycosaminoglycans，GAGs）不能降解，在各種組織尤其是結(jié)締組織的溶酶體中貯積，導(dǎo)致多器官的進(jìn)行性損壞。該病目前沒有有效的治療方法，所以產(chǎn)前診斷顯得尤為重要。

目前，MPS II的產(chǎn)前診斷主要通過B超介導(dǎo)下經(jīng)腹在孕早期（11～13周）或孕中期（16～20周）采集胎兒的絨毛組織或羊水進(jìn)行酶學(xué)診斷。若絨毛、羊水上清和經(jīng)培養(yǎng)羊水細(xì)胞中IDS 酶活性明顯低于正常范圍，且性別測定胎兒為男性，則為受累男性胎兒。前期產(chǎn)前診斷中發(fā)現(xiàn)，MPS II患者母親再次妊娠時(shí)，外周血血漿中IDS 發(fā)生規(guī)律性變化，并與胎兒的基因型相關(guān)［2］。本研究在進(jìn)行常規(guī)有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的同時(shí)，對36例孕婦外周血血漿在孕前和不同孕周進(jìn)行IDS酶活性測定，根據(jù)酶活性變化趨勢推測胎兒是否受累，其結(jié)果與絨毛或經(jīng)培養(yǎng)羊水細(xì)胞的IDS酶活性進(jìn)行對比，初步探討孕婦外周血血漿中酶活性變化的機(jī)理，確定無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的可行性。

對象與方法

一、研究對象

本研究中36例孕婦為2010～2013年期間在北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦，在兒科遺傳門診與孕婦簽署知情同意書。每例先證者皆從臨床表現(xiàn)、尿甲苯胺藍(lán)試驗(yàn)、IDS酶活性測定得到確診，部分患者還進(jìn)行了基因突變分析。

二、母親孕前和孕中不同時(shí)期的新鮮外周血血漿中IDS酶活性測定

血漿標(biāo)本檢測時(shí)用去離子水稀釋5倍后，每管取20μl測定酶活性，按文獻(xiàn)［2］方法測定。每次酶活性測定時(shí)設(shè)平行的正常對照、陽性對照，并設(shè)β葡糖苷酸酶的平行對照，以確認(rèn)蛋白制備物沒有失活，保證方法的可靠性和標(biāo)本的準(zhǔn)確性。

三、胎兒絨毛組織或經(jīng)培養(yǎng)羊水細(xì)胞的IDS酶活性測定

將絨毛組織或培養(yǎng)后的羊水細(xì)胞置冰浴中用超聲粉碎儀破碎，制成細(xì)胞勻漿，按BCA 法測蛋白濃度。取20μl適度稀釋的細(xì)胞勻漿按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法測定酶活性，酶活性單位為nmol／4h·mg蛋白。每次酶活性測定時(shí)設(shè)平行的正常對照、陽性對照，并設(shè)β-半乳糖苷酶參考酶的平行對照，以確認(rèn)蛋白制備物沒有失活，保證方法的可靠性和標(biāo)本的準(zhǔn)確性。

四、胎兒性別鑒定和基因突變分析

為了確保胎兒標(biāo)本的一致性，利用酶活性測定后的胎兒細(xì)胞勻漿直接提取DNA，進(jìn)行分子診斷。使用X、Y 染色體的引物進(jìn)行雙重PCR 擴(kuò)增，鑒定胎兒性別。引物序列為：

ZFXY：FAM-5’-ATTTGTTCTAAGTCGCCATATTCTCT-3’（X 與Y 染色體共有序列）；

ZFX：5’-AGACACACTACTGAGCAAAATGTATA-3’（X 染色體特異的序列）；

ZFY：5’-CATCAGCTGAAGCTTGTAGACACACT-3’（Y 染色體特異的序列）。

另外，對胎兒DNA 進(jìn)行序列測定，檢測先證者所具有的IDS基因突變（文章撰寫中），從基因水平判定胎兒的基因型。

五、數(shù)據(jù)處理

使用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

將胎兒按產(chǎn)前診斷結(jié)果分為4組：男性不受累胎兒、女性非攜帶者胎兒、男性受累胎兒和女性攜帶者胎兒。每組的孕前、孕早期和孕中期孕婦外周血血漿IDS酶活性計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，繪制酶活性變化趨勢圖。同時(shí)，對4組不同孕周的酶活性值進(jìn)行重復(fù)測量方差分析。

結(jié) 果

一、有創(chuàng)性胎兒組織／羊水檢測結(jié)果

37例胎兒的絨毛組織或經(jīng)培養(yǎng)后的羊水細(xì)胞分別測定了胎兒IDS 酶活性、胎兒性別鑒定，大部分胎兒進(jìn)行了基因突變分析。37例胎兒產(chǎn)前診斷結(jié)果為：7例男性不受累胎兒、12例女性非攜帶者胎兒、7例男性受累胎兒、9例女性攜帶者胎兒和1例雙胎（一男一女，不受累）。

二、母親孕前和孕早、中期的新鮮外周血血漿IDS酶活性測定結(jié)果

36例孕婦收集到孕前、孕早期（孕12周）和孕中期（孕17周）的新鮮外周血漿，并測定了IDS酶活性。29例孕婦（包括1例雙胎孕婦）外周血漿中IDS酶活性測定顯示孕后較孕前升高，其余7例孕婦外周血漿中IDS酶活性值顯示孕后較孕前有所下降（表1）。

除雙胎外，按男性不受累、女性非攜帶者、男性受累和女性攜帶者4組胎兒將孕婦分組，分別對孕前、孕早期和孕中期孕婦外周血血漿IDS酶活性的均值繪制酶活性變化趨勢圖。

統(tǒng)計(jì)的差異檢驗(yàn)顯示當(dāng)胎兒為男性不受累和女性非攜帶者時(shí)，這兩組之間在不同孕周的IDS活性沒有顯著差異（P＞0.05），故可以將此兩種胎兒合并為正常胎兒；而當(dāng)胎兒為男性受累或女性非攜帶者時(shí)，與其他組的孕婦外周血血漿IDS酶活性均存在顯著性差異（P＜0.05）（表2）。

孕婦血漿IDS酶活性趨勢圖顯示，當(dāng)胎兒為正常胎兒（男性非受累和女性非攜帶者）時(shí)，孕婦外周血血漿中IDS酶活性在孕早期就明顯升高，且隨著孕周的增加繼續(xù)升高；當(dāng)胎兒為女性攜帶者時(shí)，孕婦外周血血漿中IDS酶活性早期也升高，有隨著孕周增加而升高的整體趨勢，但升高的幅度較正常胎兒小；當(dāng)為男性受累胎兒時(shí)，孕婦外周血血漿中IDS酶活性早期即顯示低于孕前，且隨著孕周的增加，酶活性繼續(xù)降低（表2，圖1）。

三、1例雙胎孕婦的檢測結(jié)果

1例雙胎病例，孕前測定孕婦外周血血漿IDS酶活性為224.4nmol／4h·ml，孕12周時(shí)測定其外周血血漿IDS酶活性值為297.5nmol／4h·ml，酶活性比孕前有所升高。孕17周時(shí)經(jīng)羊水穿刺，分別測定培養(yǎng)羊水細(xì)胞中IDS的酶活性、胎兒性別鑒定和胎兒IDS基因分析，得出雙胎中一胎為男性不受累胎兒，另一胎為女性攜帶者。

討 論

早在1984年有研究表明正常孕婦血漿中β-氨基己糖苷酶A、β-葡糖苷酸酶等多種溶酶體酶的酶活性升高，到妊娠末期可以升高到妊娠前的3～4倍［3］。最初認(rèn)為這種增加可能是母親本身因懷孕代謝狀態(tài)變化導(dǎo)致的。有研究發(fā)現(xiàn)黏脂貯積癥Ⅱ型（mucolipidosisⅡ）雜合子孕婦當(dāng)胎兒為患者時(shí)，母親外周血血漿中β-hexosaminidase活性異常升高，認(rèn)為該水解酶可分泌入包括羊水在內(nèi)的各種細(xì)胞外液中，胎兒和母親進(jìn)行物質(zhì)交換致母血血漿中酶異常升高［4］。由于IDS同樣屬于溶酶體水解酶，在常規(guī)酶活性測定中，患者外周血血漿和白細(xì)胞內(nèi)的IDS酶活性，均可檢測到明顯低于正常范圍。

表1 36例孕婦IDS酶活性變化及產(chǎn)前診斷結(jié)果

表2 不同妊娠結(jié)局的孕婦血漿IDS酶活性的變動(dòng)（±s）

表2 不同妊娠結(jié)局的孕婦血漿IDS酶活性的變動(dòng)（±s）

注：與男性不受累或女性非攜帶者同期比較，＊P＜0.05；與女性攜帶者同期比較，＃P＜0.05；各組自身不同孕期之間比較，※P＜0.05

孕婦血漿IDS酶活性（nmol／4h·ml）胎兒表型 例數(shù)孕前 孕12周 孕17周男性不受累 7 283.4±81.6※ 470.5± 89.4※ 507.9± 81.0※男性受累 7 160.5±47.5＊＃ 145.8± 36.8＊＃ 144.9± 45.8＊＃女性非攜帶者 12 306.0±85.5※ 455.8±129.4※ 513.3±157.6※女性攜帶者 9 214.9±74.8＊※ 327.6±133.4＊※ 375.3±120.4＊※

圖1 35例單胎妊娠孕婦孕前、孕早期和孕中期外周血IDS酶活性趨勢圖

本研究入組的36名孕婦的孕前外周血血漿的IDS活性值多數(shù)趨近于血漿正常范圍的低線，該正常參考范圍（240.8～668.2nmol／4h·ml）是本實(shí)驗(yàn)室從大量無關(guān)個(gè)體中建立的。孕婦的孕前IDS酶活性值偏低可以間接提示其為攜帶者，早年有研究已證明MPS II攜帶者血漿中IDS活性比非攜帶者女性低［5］。

除1例雙胎孕婦外，其余35例單胎孕婦外周血血漿中孕前和孕中不同時(shí)期IDS 酶活性變化經(jīng)嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)后，男性不受累和女性非攜帶者胎兒（無突變正常胎兒）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，無突變正常胎兒與女性攜帶者胎兒、男性受累胎兒兩兩之間均存在顯著差異。當(dāng)胎兒為正常胎兒時(shí)，孕婦外周血血漿中IDS酶活性在孕早期就明顯升高，且隨著孕周的增加繼續(xù)升高；當(dāng)胎兒為女性攜帶者時(shí)，孕婦外周血血漿IDS酶活性早期雖也升高，其升高的幅度較正常胎兒小，但整體趨勢也為隨著孕周增加而升高；當(dāng)為男性受累胎兒時(shí)，孕婦外周血血漿中IDS酶活性早期即顯示酶活性低于孕前，且隨著孕周的增加，酶活性繼續(xù)降低。

在研究過程中發(fā)現(xiàn)（數(shù)據(jù)未顯示），孕育正常胎兒的孕婦，最早在孕8周時(shí)就測得外周血漿IDS酶活性已比孕前有所升高，該結(jié)果顯示通過孕婦外周血血漿IDS 酶活性測定可比有創(chuàng)的產(chǎn)前診斷（孕11～12周）提前3～4 周獲得胎兒的表型信息。同時(shí)，我們每間隔兩周測定孕婦新鮮外周血血漿IDS酶活性變化，結(jié)果顯示兩周時(shí)間可以得到活性變化趨勢，為將來在實(shí)際工作中運(yùn)用孕婦外周血酶活性測定提供了依據(jù)。當(dāng)然，本研究只是從不足40例孕婦中獲得的結(jié)果，在將來應(yīng)用到臨床產(chǎn)前診斷還需要通過更多的病例驗(yàn)證，得到更完善的信息。

IDS酶活性變化機(jī)制還不清楚，以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示可能與mucolipidosis Ⅱ相似。推測孕婦外周血中IDS 的變化除母親本身酶的量隨孕期的改變外，可能是正常胎兒來源的大量IDS轉(zhuǎn)運(yùn)到母親血液中，導(dǎo)致孕婦外周血中的酶活性更進(jìn)一步升高；而母親血漿中IDS酶活性降低，則可能是相反的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，是母親的IDS進(jìn)入胎兒代償胎兒的缺陷。已經(jīng)明確母血中某些胎兒特有的蛋白，如α甲胎蛋白從胎兒的羊水轉(zhuǎn)移到母血中，故可以通過母血檢測胎兒發(fā)育情況。另外，我們也從多年的實(shí)踐中，觀察到羊水中IDS的正常濃度范圍相對較高，進(jìn)一步支持以上推理。另一個(gè)可能的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，母血中IDS可能還來源于胎膜（絨毛膜和羊膜）本身。研究發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)母親與胎兒之間物質(zhì)交換的酶多數(shù)為高度唾液酸化的［4］。MPS Ⅱ中，IDS胎兒來源的物質(zhì)進(jìn)入母親體內(nèi)唾液酸化（sialylation）作用機(jī)理目前仍不清楚。這種唾液酸化可使胎兒來源的IDS 不能被母親體內(nèi)細(xì)胞（如肝細(xì)胞）重新攝取而降解，故在血液循環(huán)中不丟失而持續(xù)升高。

本研究中一例異卵雙胎妊娠的孕婦，在孕前和孕早期測定IDS酶活性，顯示有所增加，胎兒性別和培養(yǎng)羊水細(xì)胞酶活性測定結(jié)果顯示，一個(gè)胎兒為非受累男胎，另一胎為攜帶者女胎。對于雙胎孕婦，由于影響因素較多，通過孕婦外周血血漿IDS酶活性測定暫時(shí)無法對胎兒狀況作出判斷。

目前，MPS II的產(chǎn)前診斷主要通過B 超介導(dǎo)下經(jīng)腹 在 孕 早 期（11～13 周）或 孕 中 期（16～20周）采集胎兒的絨毛組織或羊水進(jìn)行酶學(xué)診斷。若絨毛、羊水上清和培養(yǎng)羊水細(xì)胞中IDS酶活性明顯低于正常范圍，且經(jīng)性別測定為男性，則判斷為受累男性胎兒。產(chǎn)前診斷是一種有創(chuàng)的診斷，且最早取材時(shí)期為孕11 周左右。隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，目前通過孕婦外周血游離DNA 進(jìn)行胎兒無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷也隨之有了進(jìn)展，受技術(shù)和經(jīng)濟(jì)條件的限制，目前高通量技術(shù)在臨床上主要用于染色體非整倍體（主要是21、18、13、X 和Y 染 色 體）的 拷 貝 數(shù) 異 常 檢 測［6-9］，但 對 于 單基因遺傳病的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷，目前研究主要是通過單體型連鎖分析，經(jīng)驗(yàn)相對少。在孕期胎兒與母親之間通過胎盤屏障進(jìn)行物質(zhì)交換，IDS酶可以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入母親外周血循環(huán)，本研究發(fā)現(xiàn)孕婦外周血血漿中IDS 酶活性隨著孕周增加而變化，并通過35 例產(chǎn)前有創(chuàng)診斷，確定這種變化趨勢與胎兒的性別和基因型密切相關(guān)，凡IDS酶活性逐漸下降的妊娠胎兒是男性受累胎兒，凡上升的則為獲得母源正常等位基因或獲得致病突變基因的女性攜帶者，可以繼續(xù)妊娠。這可以作為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的一種途徑，對將來其他酶代謝相

關(guān)遺傳疾病的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷有一定啟示作用。

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