趙芳，呂玉珍，王娟，田可可

（河南省焦作市婦幼保健院生殖中心，焦作 454000）

近年來(lái)體外受精-胚胎移植技（IVF-ET）術(shù)飛速發(fā)展，但較低的臨床妊娠率和胚胎種植率仍然是生殖醫(yī)學(xué)工作者面臨的難題。囊胚期胚胎移植技術(shù)可通過(guò)選擇發(fā)育潛能較高的胚胎以提高胚胎種植率，減少移植胚胎數(shù)。激光輔助孵化（laser assisted hatching，LAH）應(yīng)用于凍融胚胎移植（FET）中已有多年，但能否有助于提高臨床妊娠率和胚胎種植率，目前尚有爭(zhēng)議。本研究分析囊胚移植結(jié)合LAH 在玻璃化凍融周期中的應(yīng)用，旨在探討提高胚胎種植率的方法。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2013年5月至2014年10月期間在河南省焦作市婦幼保健院生殖中心行玻璃化凍融移植的639個(gè)周期，患者新鮮周期移植失敗或因各種原因新鮮周期未移植行全胚冷凍。根據(jù)解凍胚胎天數(shù)以及是否行LAH，分為4組：A 組（解凍D3胚胎，行LAH）、B組（解凍D3胚胎，不行LAH）、C組（解凍D6囊胚，行LAH）、D 組（解凍D6囊胚，不行LAH）。排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮內(nèi)膜薄、子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管積水、染色體異常、生殖系統(tǒng)畸形、解凍5期和6期囊胚［1］的患者。

二、研究方法

1.促排卵及IVF-ET：采用本中心常規(guī)方法進(jìn)行促排卵、取卵、體外受精和胚胎培養(yǎng)（Quinn’s 系列，Sage，美國(guó)）。根據(jù)卵裂球均勻度、碎片比例和發(fā)育速度等進(jìn)行胚胎質(zhì)量評(píng)估。D3選擇2～3枚胚胎移植，移植后剩余的胚胎經(jīng)患者知情同意后，冷凍保存或繼續(xù)培養(yǎng)至D5／D6形成囊胚后冷凍保存。囊胚評(píng)分依據(jù)Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［1］。FET 子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備方案采用自然周期或激素替代周期。

2.胚胎的玻璃化冷凍：囊胚在冷凍前行激光法人工皺縮，待囊腔近完全皺縮后冷凍。使用Medi?ult試劑盒（Origio，丹麥），室溫下先將胚胎轉(zhuǎn)移入基礎(chǔ)（BS）液，1 min后轉(zhuǎn)移至平衡（ES）液，在ES液中平衡時(shí)間卵裂期胚胎為3～5min，囊胚為5～8min。再將胚胎轉(zhuǎn)移至玻璃化（VS）液，60s 內(nèi)將胚胎裝載至冷凍載桿（Medicult）上，投入液氮保存。

3.玻璃化冷凍胚胎的解凍：將裝載有胚胎的載桿放入37℃預(yù)溫的解凍液WS1，胚胎在WS1液中停留1min，依次轉(zhuǎn)移胚胎至解凍液WS2、3、4液各停留3min，將胚胎轉(zhuǎn)移入平衡好的10% 人血清白蛋白（HSA）1029 微滴中。解凍后胚胎復(fù)蘇的細(xì)胞數(shù)≥50%總細(xì)胞數(shù)為胚胎復(fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)蘇率＝復(fù)蘇胚胎數(shù)／解凍胚胎數(shù)。

4.LAH 及胚胎移植：卵裂期胚胎解凍后2～3h移植，在移植前1h 行LAH，使用非接觸式激光顯微操作系統(tǒng)（OCTAX，德國(guó)），選取卵周間隙相對(duì)較大或碎片較多的區(qū)域，調(diào)整激光靶心使其位于削薄區(qū)透明帶外緣，點(diǎn)擊激光發(fā)射鍵，形成寬度為1／4透明帶周長(zhǎng)、深度為透明帶厚度2／3 的薄化區(qū)。5期以下囊胚在解凍后立即行LAH，在卵周間隙較大的區(qū)域削除1／4透明帶周長(zhǎng)［2］，移入移植皿中繼續(xù)培養(yǎng)2～3h至移植。移植后給予黃體支持，移植后14d驗(yàn)血HCG，移植后30dB超見(jiàn)孕囊為臨床妊娠。

5.觀察指標(biāo)：復(fù)蘇率、臨床妊娠率、胚胎種植率、多胎率、流產(chǎn)率、異位妊娠率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、患者一般情況的比較

A 組和B 組患者的年齡、平均ET 胚胎數(shù)均高于C組和D 組（P＜0.05）。四組患者ET 日子宮內(nèi)膜厚度、復(fù)蘇率、不孕因素、受精方式和內(nèi)膜準(zhǔn)備方案均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

二、患者妊娠結(jié)局的比較

C組和D 組患者的臨床妊娠率、胚胎種植率顯著高于A 組和B組（P＜0.05）；A 組與B 組的臨床妊娠率、胚胎種植率和多胎率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；C 組的胚胎種植率和多胎率顯著高于D 組（P＜0.05）；四組患者的流產(chǎn)率、異位妊娠率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表2）。

表1 四組患者一般情況的比較［（±s），n（%）］

表1 四組患者一般情況的比較［（±s），n（%）］

注：與A 組、B組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 年齡（歲） 不孕年限（年） 原發(fā)不孕 繼發(fā)不孕IVF A 組 181 31.51±5.56 4.30±3.75 81（45.30） 99（54.70） 108（59.67）B組 304 30.56±5.30 4.03±3.31 158（51.97） 146（48.03） 178（58.55）C組 81 27.32±3.59＊ 3.11±1.84＊ 44（54.32） 37（45.68） 48（59.26）D 組 73 27.92±3.94＊ 3.60±2.81 44（60.27） 29（39.73） 44（60.27）組 別 例數(shù) ICSI 自然周期 激素替代周期 復(fù)蘇率 ET 日內(nèi)膜厚度（mm）ET 胚胎數(shù)（枚）A 組 181 73（40.33） 45（24.86） 136（75.14） 412／417（98.80）9.36±1.84 2.29±0.52 B組 304 126（41.45） 80（26.32） 224（73.68） 726／735（98.78） 9.69±1.83 2.38±0.52 C組 81 33（40.74） 24（29.63） 57（70.37） 153／153（100.00） 9.36±1.65 1.89±0.32＊D 組 73 29（39.73） 20（27.40） 53（72.60） 142／142（100.00） 9.81±1.52 1.96±0.20＊

表2 四組患者妊娠結(jié)局的比較［n（%）］

討 論

近年來(lái)，人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的進(jìn)步為不孕癥患者帶來(lái)了福音，但目前IVF-ET 的胚胎種植率仍相對(duì)較低，是生殖醫(yī)學(xué)中需要解決的瓶頸問(wèn)題。本文通過(guò)比較卵裂期胚胎與囊胚凍融移植周期中LAH對(duì)妊娠結(jié)局的影響，旨在探討提高胚胎種植率的方法。

隨著胚胎培養(yǎng)體系和條件的逐漸改善，囊胚培養(yǎng)和移植在IVF 中得到了廣泛的應(yīng)用。延長(zhǎng)胚胎體外培養(yǎng)的時(shí)間更有利于選擇出具有發(fā)育潛能的胚胎。而且，囊胚細(xì)胞數(shù)目多，凍融后即使有少數(shù)細(xì)胞死亡，對(duì)胚胎的發(fā)育潛能影響也較小［3］。本結(jié)果表明，囊胚與卵裂期胚胎都達(dá)到了較高的復(fù)蘇率，兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示囊胚與卵裂期胚胎均適用于玻璃化冷凍。有研究［4-5］報(bào)道，與卵裂期胚胎比較，凍融囊胚復(fù)蘇移植周期具有更高的種植率、臨床妊娠率，而流產(chǎn)率、早產(chǎn)率及新生兒出生缺陷率無(wú)明顯差異。本研究結(jié)果與之報(bào)道一致。囊胚凍融移植組（C、D 組）的平均移植胚胎數(shù)低于卵裂期胚胎凍融移植組（A、B 組），但臨床妊娠率和胚胎種植率均高于A 組和B 組（P＜0.05），說(shuō)明凍融周期中，與卵裂期胚胎比較，囊胚移植可獲得更好的臨床結(jié)局。林明媚等［6］報(bào)道，囊胚移植比D3 胚胎移植流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)降低。本研究中，四組患者采用相同的黃體支持方案，囊胚組（C、D 組）的流產(chǎn)率略低于卵裂期胚胎組（A、B組），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

LAH 技術(shù)是人為地對(duì)透明帶進(jìn)行薄化、打孔或者去除，以提高胚胎的孵出和種植能力。LAH具有胚胎暴露時(shí)間短、定位準(zhǔn)確、快速有效、相對(duì)安全等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用。由于卵裂期胚胎和囊胚具有不同的特點(diǎn)，本研究對(duì)其采用不同的方法行LAH。卵裂期胚胎透明帶間隙小，完全打斷透明帶容易造成卵裂球損傷，采用LAH 削薄部分透明帶更安全，結(jié)局更好［7］。本研究中對(duì)卵裂期胚胎采用透明帶部分削薄，可以保存透明帶對(duì)卵裂期胚胎的保護(hù)作用，又使胚胎形成囊胚后易于孵出。關(guān)于LAH 對(duì)凍融胚胎移植周期的臨床結(jié)局的影響，目前意見(jiàn)不一［8-9］。本研究結(jié)果提示，卵裂期胚胎凍融移植組中，輔助孵化組（A 組）的臨床妊娠率和胚胎種植率略高于未行輔助孵化組（B 組），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），與洪焱等［10］報(bào)道結(jié)果一致。人類(lèi)透明帶由內(nèi)外兩層構(gòu)成，其中內(nèi)層致密，在囊胚發(fā)育過(guò)程中不易薄化和擴(kuò)張。采用激光削薄方法行輔助孵化僅將透明帶外層結(jié)構(gòu)薄化，內(nèi)層結(jié)構(gòu)仍然完整，并不能有效幫助胚胎孵出和種植，這可能是出現(xiàn)本研究結(jié)果的原因。因此，本研究提示，LAH 并不能提高玻璃化凍融卵裂期胚胎的臨床妊娠率和胚胎種植率，不必對(duì)所有玻璃化凍融的卵裂期胚胎常規(guī)行LAH。

本研究對(duì)象未納入解凍5期 和6期囊胚的患者，排除了囊胚自然孵出的影響。有研究顯示，對(duì)胚胎行LAH 更適合選擇在囊胚期［11-12］，且在玻璃化凍融囊胚移植周期中應(yīng)用長(zhǎng)透明帶切割技術(shù)后，囊胚的完全孵出率、胚胎種植率和臨床妊娠率均高于傳統(tǒng)的部分透明帶切割法［13］，提示對(duì)囊胚行LAH時(shí)，開(kāi)孔較大有利于囊胚的順利孵出。本研究中囊胚解凍后立即行LAH，采用激光削除1／4周長(zhǎng)的透明帶，此時(shí)透明帶與皺縮的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)間空隙很大，操作簡(jiǎn)單且不會(huì)損傷囊胚的滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，透明帶開(kāi)孔大，有利于囊胚順利孵出，而且內(nèi)細(xì)胞孵出時(shí)不易嵌頓，理論上降低了單卵雙胎的發(fā)生率。凍融后立即行LAH 也有利于細(xì)胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑更好擴(kuò)散，有利于增加囊胚與子宮內(nèi)膜間的對(duì)話和相互作用。本研究數(shù)據(jù)顯示，囊胚凍融移植組中行LAH 組（C組）患者的胚胎種植率和多胎率顯著高于未行LAH 組（D 組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其臨床妊娠率稍高于未行LAH 組（D 組），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。提示囊胚解凍后行LAH 后可提高胚胎種植率，但多胎率較高，建議今后行凍融單囊胚移植，降低移植胚胎數(shù)目，從而降低多胎率。四組患者的異位妊娠率均較低，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。關(guān)于LAH 帶來(lái)的熱效應(yīng)對(duì)胚胎和子代的遠(yuǎn)期影響，尚有待進(jìn)一步大樣本的研究。

綜上所述，LAH 并不能提高卵裂期胚胎的臨床妊娠率和胚胎種植率，不必對(duì)所有玻璃化凍融的卵裂期胚胎常規(guī)行LAH。在玻璃化凍融周期中應(yīng)用囊胚移植結(jié)合LAH 可提高患者的胚胎種植率，達(dá)到較好的臨床妊娠結(jié)局。

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