李強(qiáng)，崔向榮，井宣，王振強(qiáng)，義建偉，武學(xué)清＊

（1.山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，太原 030000；2.山西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，太原 030000；3.太原市中心醫(yī)院輔助生殖醫(yī)學(xué)中心，太原 030000）

精子DNA 損傷會(huì)降低精子受精能力和胚胎發(fā)育潛能，從而降低妊娠率，同時(shí)還會(huì)使流產(chǎn)率增高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1］，吸煙不僅可引發(fā)男性精子濃度及活力的降低，還可導(dǎo)致精液中活性氧（ROS）水平的顯著升高，進(jìn)而產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起精子細(xì)胞膜的改變，甚至引發(fā)精子DNA 的損傷。研究發(fā)現(xiàn)［2］，細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1（Chk1）表達(dá)的下降可引發(fā)細(xì)胞損傷后修復(fù)功能的缺失，進(jìn)而導(dǎo)致DNA 損傷檢測(cè)點(diǎn)失去作用。然而吸煙患者精液質(zhì)量下降及精子DNA 損傷增加是否與Chk1的下調(diào)相關(guān)，目前尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定吸煙者與不吸煙者的Chk1基因表達(dá)差異，探討吸煙對(duì)男性精液質(zhì)量的影響與DNA 完整性及損傷后修復(fù)相關(guān)基因Chk1 表達(dá)的相關(guān)性。

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

選擇2014年2月至2015年2月于山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的男性患者1 128例為研究對(duì)象，平均年齡（34.18±3.79）歲，其中吸煙組841例，不吸煙組287例。無(wú)外傷及遺傳性疾病家族史，性功能正常，體檢無(wú)明顯睪丸、附睪及輸精管異常，無(wú)感染及其它全身性疾病。除外生活或工作環(huán)境有污染、酗酒、精索靜脈曲張及無(wú)精子癥的患者。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織對(duì)吸煙情況的標(biāo)準(zhǔn)化建議，將研究對(duì)象分為不吸煙組（從未吸煙男性）和吸煙組（經(jīng)常吸煙者：每天吸煙1支以上，且連續(xù)或累計(jì)吸煙6個(gè)月以上）。依據(jù)每天吸煙支數(shù)，將吸煙組患者劃分為：輕度吸煙組（230例）：日吸煙量≤9支，中度吸煙組（345例）：日吸煙量10～≤19支，重度吸煙組（266例）：日吸煙量≥20支；同時(shí)依據(jù)吸煙年限將吸煙組患者劃分為：短煙齡組（238例）：吸煙年限≤5年，中煙齡組（269例）：吸煙年限5～10年，長(zhǎng)煙齡組（334例）：吸煙年限≥10年［3］。同時(shí)對(duì)患者一般情況（年齡、職業(yè)、煙、酒習(xí)慣）進(jìn)行詳細(xì)詢問(wèn)。研究對(duì)象均取得本人同意且簽署知情同意書，并由醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)。

二、研究方法

1.精液標(biāo)本收集：研究對(duì)象行精液檢查前禁欲2～7d，手淫法取精，裝入無(wú)菌、干燥、清潔、無(wú)毒取精杯中，用去皮稱重法計(jì)算精液量，置37℃水浴鍋內(nèi)液化，經(jīng)30～60min液化后，肉眼觀察精液顏色、粘稠度，用pH 試紙檢測(cè)pH 值，采用西班牙SCA全自動(dòng)精液質(zhì)量分析系統(tǒng)進(jìn)行精液參數(shù)分析。另分別取1ml進(jìn)行精漿鋅、頂體酶和精子DNA 完整性檢測(cè)。

2.精液常規(guī)分析：采用西班牙SCA 全自動(dòng)精液質(zhì)量分析系統(tǒng)，按照《WHO 人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（2011年，第5版）標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)吸煙組與不吸煙組進(jìn)行精液濃度、精子活率、活力進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用改良巴氏染色法對(duì)患者精液進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

3.吖啶橙染色法檢測(cè)精子DNA 完整性：按照精子核染色試劑盒（深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程）的檢測(cè)方法，對(duì)DNA 完整性進(jìn)行檢測(cè)。步驟簡(jiǎn)述如下：待精液液化后，取1.0ml精液離心10min（1 000g）去除精漿。加入1 ml洗滌液，混勻后離心5 min（1 000g），去上清。洗滌兩次后，棄上清，調(diào)整精子濃度為50×106／ml。取懸浮液涂片，晾干，固定10min。吖啶橙工作液染色5 min后，于熒光顯微鏡高倍鏡下觀察。計(jì)數(shù)200條精子，其中綠色代表DNA 雙鏈精子，紅色代表DNA 單鏈精子，橙黃色代表DNA 雙鏈不穩(wěn)定鑿開(kāi)精子。計(jì)算雙鏈DNA精子百分率。

4.精子Chk1基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)：取精液標(biāo)本于13 000r／min條件下離心15min，去上清，隨后PBS洗滌3次，置于1ml Trizol提取液中，提取精子總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后于-80℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩２捎脤?shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-QPCR）法，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以β-actin作為內(nèi)參，并優(yōu)化反應(yīng)條件，使目的基因與內(nèi)參的擴(kuò)增效率近似相等且接近100%，Ct值代表基因的起始拷貝數(shù)，可根據(jù)Ct值比較基因的表達(dá)量。ΔΔCt＝（Ct目的基因Ct內(nèi)參基因）（Ct陰性對(duì)照Ct內(nèi)參基因），以2-ΔΔCt計(jì)算各組mRNA的相對(duì)表達(dá)量。基因引物序列如下：Chk1上游引物：5TGAAGCCGGCCGTAGACT3，下游引物：5TCCACAGGACCAAACATC3；β-actin上游引物：5TGTACGTTGCTATCCAGGCT3，下游引物：5CTCCTTAATGTCACGCACGA3，所有引物均由上海Invitrogen生物工程有限公司合成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本數(shù)據(jù)資料運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用±s表示，兩組間均數(shù)比較，采用t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)；率的比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman，結(jié)果用相關(guān)系數(shù)r 表示相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況比較

本研究中不吸煙組共287 例，平均年齡為（34.32±3.43）歲，吸煙組841例，平均年齡為（33.98±3.99）歲，兩組年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），可排除年齡對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響。

二、不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精液常規(guī)參數(shù)比較

吸煙組與不吸煙組及日吸煙量各組相比，精液量、精液濃度及精子總數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；吸煙組的前向運(yùn)動(dòng)精子率較不吸煙組顯著下降（P＜0.05），其中輕度吸煙組與不吸煙組相比，前向運(yùn)動(dòng)精子率無(wú)顯著差異（P＞0.05），中度及重度吸煙組與不吸煙組相比，前向運(yùn)動(dòng)精子率顯著降低（P＜0.05）（表1）。

三、不吸煙組與不同吸煙年限組間精液常規(guī)參數(shù)的比較

長(zhǎng)煙齡組精液量、濃度、總數(shù)及前向運(yùn)動(dòng)精子率低于不吸煙組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。短煙齡組與不吸煙組相比，各精液常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。中煙齡組較不吸煙組，前向運(yùn)動(dòng)精子率顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各項(xiàng)與不吸煙組相比，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（表2）。

四、不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精子形態(tài)學(xué)比較

經(jīng)巴氏染色后，于顯微鏡下計(jì)數(shù)200條精子，計(jì)算各組正常精子率及頭、體、尾各段異常精子率。其中不吸煙組的正常精子率及各段異常精子率與總吸煙組及輕、中度吸煙組相比無(wú)顯著性差異（P ＞0.05），而重度吸煙組的頭部精子缺陷率顯著高于不吸煙組（P＜0.05）（表3）。

表1 不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精液常規(guī)參數(shù)比較（±s）

表1 不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精液常規(guī)參數(shù)比較（±s）

注：與不吸煙組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 精液量（ml） 精液濃度（×106／ml） 精子總數(shù)（×106） 前向運(yùn)動(dòng)精子率（%）不吸煙組 287 3.62±1.38 45.37±26.83 49.29±30.29 26.97±11.66吸煙組 841 3.45±1.17 41.47±22.94 45.62±32.94 18.16±10.48＊ 輕度吸煙組 230 3.52±1.08 44.39±23.42 47.27±29.95 26.52±11.63 中度吸煙組 345 3.39±1.21 42.61±28.26 45.74±31.44 19.48±10.24＊ 重度吸煙組 266 3.46±1.33 40.03±26.73 43.28±30.61 15.29±9.27＊

表2 不吸煙組與不同吸煙年限組間精液常規(guī)參數(shù)的比較（±s）

表2 不吸煙組與不同吸煙年限組間精液常規(guī)參數(shù)的比較（±s）

注：與不吸煙組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 精液量（ml） 精液濃度（×106／ml） 精子總數(shù)（×106） 前向運(yùn)動(dòng)精子率（%）不吸煙組 287 3.62±1.38 45.37±26.83 49.29±30.29 26.97±11.66短煙齡組 238 3.58±1.14 43.55±21.39 48.37±22.56 25.69±10.18中煙齡組 269 3.42±1.62 41.69±24.11 44.74±21.39 18.79±11.24＊長(zhǎng)煙齡組 334 2.19±1.03＊ 28.95±23.22＊ 38.67±18.22＊ 13.29±10.43＊

表3 不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精子形態(tài)學(xué)比較（±s）

表3 不吸煙組與吸煙組及日不同吸煙量組間精子形態(tài)學(xué)比較（±s）

注：與不吸煙組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 正常形態(tài)精子（%） 頭部缺陷精子（%） 中段缺陷精子（%） 尾部缺陷精子（%）不吸煙組 287 7.21±1.48 82.50±10.66 41.28±9.58 6.13±7.49吸煙組 841 6.53±1.33 88.32±15.21 49.22±14.23 10.64±11.77 輕度吸煙組 230 7.11±1.28 85.36±12.10 47.63±12.33 9.37±8.63 中度吸煙組 345 6.98±1.55 86.01±10.26 46.51±14.82 10.59±10.12 重度吸煙組 266 6.14±1.03 98.21±18.74＊52.38±14.33 12.29±14.81

五、不吸煙組與不同吸煙年限組間精子形態(tài)學(xué)比較

不吸煙組的正常精子率及各段異常精子率與短煙齡組及中、長(zhǎng)煙齡組相比無(wú)顯著性差異（P ＞0.05），而長(zhǎng)煙齡組的頭部精子缺陷率顯著高于不吸煙組（P＜0.05）（表4）。

六、吸煙組與不吸煙組精子DNA 完整性比較

隨機(jī)選取200例男性患者，進(jìn)行精子DNA 完整性檢測(cè)，其中不吸煙者98例，吸煙者102例。吸煙組中DNA 完整精子比例為34%，顯著低于不吸煙組（77%）（P＜0.05）（圖1）。

七、精子DNA 完整性與精液濃度及活力的相關(guān)性

精子DNA 完整性與男性精液濃度及前向運(yùn)動(dòng)精子率之間存在一定程度的相關(guān)性（P ＜0.05）（表5）。

表4 不吸煙組與不同吸煙年限組間精子形態(tài)學(xué)比較（±s）

表4 不吸煙組與不同吸煙年限組間精子形態(tài)學(xué)比較（±s）

注：與不吸煙組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 正常形態(tài)精子（%） 頭部缺陷精子（%） 中段缺陷精子（%） 尾部缺陷精子（%）不吸煙組 287 7.21±1.48 82.50±10.66 41.28±9.58 6.13±7.49短煙齡組 238 7.42±1.22 80.91±14.75 47.88±8.96 11.59±9.61中煙齡組 269 6.49±1.16 88.17±11.77 51.94±10.26 9.27±11.17長(zhǎng)煙齡組 334 5.19±1.27 99.43±16.38＊52.50±9.73 11.31±12.09

表5 精子DNA 雙鏈精子百分率與精液濃度及活力的相關(guān)性（±s）

表5 精子DNA 雙鏈精子百分率與精液濃度及活力的相關(guān)性（±s）

參數(shù) 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 相關(guān)系數(shù)P DNA 雙鏈精子比率0.57±0.01 - -精液濃度 39.28±15.32 0.038 0.013前向運(yùn)動(dòng)精子率22.17±9.32 0.041 0.028

圖1 吸煙組與不吸煙組精子DNA 完整性比較

八、精子Chk1 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

行Chk1基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)，其中不吸煙者98例，吸煙者102例。吸煙組患者較不吸煙組患者Chk1基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 吸煙組與不吸煙組Chk1基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量

九、精子Chk1基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量與精液濃度及活力的相關(guān)性

精子Chk1 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量與男性精液濃度及前向運(yùn)動(dòng)精子率間存在正相關(guān)（P＜0.05）（表6）。

表6 精子Chk1基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量與精液濃度及活力的相關(guān)性（±s）

表6 精子Chk1基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量與精液濃度及活力的相關(guān)性（±s）

參 數(shù) 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 相關(guān)系數(shù)P Chk1基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量1.42±0.18 - -精液濃度 39.28±15.32 0.048 0.027前向運(yùn)動(dòng)精子率22.17±9.32 0.039 0.015

討 論

吸煙是重要的環(huán)境危險(xiǎn)因素，不僅可誘發(fā)肺癌、導(dǎo)致心血管疾?。?-5］，還可引起女性生育能力降低，同時(shí)由于香煙煙霧中含有多種有毒化學(xué)物質(zhì)，極易對(duì)睪丸正常的生精過(guò)程造成干擾，導(dǎo)致精液質(zhì)量的下降，進(jìn)而造成精子致孕力降低［6-7］。

現(xiàn)已證實(shí)，香煙中的尼古丁及有毒化合物可導(dǎo)致ROS在精漿內(nèi)過(guò)量積聚。過(guò)量ROS一方面可直接導(dǎo)致DNA 損傷，另一方面還可引發(fā)DNA 雙鏈斷裂或通過(guò)DNA 鏈、遺傳物質(zhì)重塑、細(xì)胞退化等機(jī)制，最終導(dǎo)致DNA 損傷［8］。對(duì)精子細(xì)胞而言，DNA的完整性不僅保證了遺傳信息的完整性，同時(shí)也對(duì)精子細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)有著重要的影響。本研究通過(guò)對(duì)吸煙及不吸煙患者精液常規(guī)參數(shù)比較及精子DNA 完整性與精液常規(guī)參數(shù)之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)吸煙可引起男性精液質(zhì)量下降，且隨著吸煙時(shí)間的延長(zhǎng)及日吸煙量的增加，精液質(zhì)量下降更為顯著。同時(shí)，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)吸煙引發(fā)的精液質(zhì)量下降與精子DNA 完整性存在一定的相關(guān)性，這表明DNA 完整性異?？赡苁菍?dǎo)致吸煙男性精液質(zhì)量下降的危險(xiǎn)因素之一。因此，DNA 損傷后修復(fù)作為DNA 完整性的調(diào)控因素，在吸煙所致精液質(zhì)量下降的機(jī)制過(guò)程中顯得至關(guān)重要。

Chk1蛋白是生物進(jìn)化過(guò)程中非常保守的蛋白激酶，其主要功能在于參與DNA 損傷引起的細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的調(diào)節(jié)［9-11］。Chk1參與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的主要機(jī)制是通過(guò)與其上游蛋白激酶ATR 組成的信號(hào)通路在DNA 復(fù)制檢查點(diǎn)及DNA 損傷檢查點(diǎn)中發(fā)揮作用［12］。而DNA 損傷檢查點(diǎn)可保證基因組DNA 損傷時(shí)，細(xì)胞可進(jìn)行及時(shí)響應(yīng)、延遲，甚至停滯細(xì)胞周期進(jìn)程，同時(shí)還可相應(yīng)的啟動(dòng)DNA 損傷的修復(fù)［13］。Chk1是G2-DNA 損傷校驗(yàn)的核心，并通過(guò)Cdc25C的磷酸化對(duì)DNA 損傷進(jìn)行應(yīng)答，進(jìn)而對(duì)受損的DNA 進(jìn)行有效修復(fù)，修復(fù)成功則繼續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期［2］。腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，Chk1基因的表達(dá)下降或失活將導(dǎo)致細(xì)胞損傷修復(fù)的缺失，進(jìn)而引發(fā)DNA 損傷檢測(cè)點(diǎn)失去作用［14］。然而吸煙男性精液質(zhì)量降低是否與Chk1的調(diào)節(jié)修復(fù)機(jī)制相關(guān)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

在本研究中發(fā)現(xiàn)吸煙組患者較不吸煙組患者Chk1基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低且精子Chk1基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量與男性精液濃度及前向運(yùn)動(dòng)精子率間存在一定程度的相關(guān)性。這一研究結(jié)果表明，在精子的調(diào)控中可能存在Chk1調(diào)控通路，即通過(guò)Chk1對(duì)精子損傷的DNA 進(jìn)行檢測(cè)修復(fù)。長(zhǎng)期大量吸煙可能引發(fā)精子細(xì)胞內(nèi)Chk1基因表達(dá)減少或缺失，進(jìn)而導(dǎo)致DNA 受損傷的精子不能實(shí)現(xiàn)G2M 期停滯，進(jìn)而不能得到有效的修復(fù)，引發(fā)精液質(zhì)量的下降。

綜上所述，Chk1基因表達(dá)下調(diào)與吸煙男性精液質(zhì)量的相關(guān)性研究將為揭示吸煙引發(fā)男性生育能力降低的研究拓展又一新的方向。然而吸煙引發(fā)Chk1基因缺失或抑制的機(jī)理及Chk1基因的DNA修復(fù)功能尚需進(jìn)一步研究。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)揭示吸煙男性精液質(zhì)量下降的相關(guān)因素，為深入探討吸煙引起的精子DNA 損傷在分子生物學(xué)水平的研究奠定基礎(chǔ)。

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