梁 薇

(錫林郭勒職業(yè)學院，026000)

本試驗主要以錫林浩特某牧場為試驗對象，采集50份患有臨床型乳房炎奶牛的奶樣和50份患有隱性乳房炎奶牛的奶樣，進行致病菌的分離、鑒定，生化鑒定和藥敏試驗。本試驗為指導臨床合理用藥和提高奶牛乳房炎防治效果提供了相關的理論依據(jù)，也為系統(tǒng)開展奶牛乳房炎致病菌的分子流行病學調查、血清學分型和耐藥性研究奠定了一定的基礎。

1 實驗材料

1.1培養(yǎng)基

普通的瓊脂培養(yǎng)基，SS瓊脂培養(yǎng)基，西檬氏枸櫞酸鹽培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯，高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基，三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基，血液瓊脂培養(yǎng)基，伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基。

1.2試劑

葡萄球菌屬細菌生化鑒定管，鏈球菌細菌生化編碼鑒定管，腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管；藥物敏感紙片。

2 實驗方法

2.1樣品采集

2015年6月，在錫林浩特某牧場采集100份奶牛乳樣，50份為臨床型乳房炎奶牛的乳樣，50份為隱性乳房炎的乳樣，這100份乳樣都符合《動物疾病實驗室檢驗手冊》的采集標準。對于患有臨床型乳房炎的奶牛，可以通過觀察奶牛的乳房情況，是否有發(fā)熱、疼痛和腫脹現(xiàn)象，另外還可以觀察患牛的乳汁，看乳汁中是否有絮片或者是凝塊和血奶，診斷確認為臨床型乳房炎以后采集奶樣。對于患有隱性乳房炎的奶牛使用CMT檢測法檢測奶牛的乳樣，經(jīng)確認為隱性乳房炎以后進行奶樣采集。采集乳樣的時候，先用碘伏對專業(yè)人員進行消毒，然后通過對酒精棉進行相關的脫碘處理，實現(xiàn)對前三把奶的處理，最終實現(xiàn)對無菌操作的進一步實現(xiàn)，在對五六毫升的奶樣進行處理的過程中放到了十毫升的無菌試管當中，使得乳頭最終能夠避免對采樣管的解除，最終將奶樣放到沐浴球上帶回實驗室中進行理論分析。

2.2致病菌分離鑒定

2.2.1分離培養(yǎng)

充分搖動采集的奶樣，然后用滅菌的生理鹽水進行稀釋，最后用滅菌的棉簽涂在普通瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基進行接種。將這些接種有乳樣的培養(yǎng)基放在37℃的恒溫箱里面培養(yǎng)24h～48h，挑選出比較典型的菌落進行涂片和革蘭染色，再做鏡檢。按照菌落的形態(tài)、染色后出現(xiàn)的特征和菌落的溶血狀況先判斷出細菌屬于哪種大類，然后再進一步培養(yǎng)觀察。

2.2.2菌種保存

使用斜面保存法對分離的菌種進行保存，針對葡萄球菌和腸道桿菌，直接接種在普通的瓊脂斜面上，然后把斜面的底部加一些無糖肉膏液，最后用橡皮塞塞好，經(jīng)過37℃恒溫箱培養(yǎng)24h～48h以后，放在4℃的冰箱里面進行保存，這種保存方法可以將菌種保存3-6個月。針對鏈球菌應當接種在血液瓊脂斜面上，然后放在37℃的恒溫箱里面培養(yǎng)24h～48h以后，也放在4℃的冰箱里面進行保存，不過需要注意的是半個月到1個月要移種一次。

2.3生化鑒定

2.3.1葡萄球菌生化鑒定

將在普通瓊脂培養(yǎng)基上長的比較好的，革蘭氏染色鏡檢結果為G＋的，以單個或者是葡萄串形狀排列的細菌，使用葡萄球菌屬細菌生化鑒定管對菌種進行鑒定，每盒10支裝，共有11種。鑒定的標準見表1。

表1 不同種葡萄球菌的鑒定標準

2.3.2鏈球菌生化鑒定

將在血瓊脂培養(yǎng)基上長的比較好的，革蘭氏染色鏡檢結果為G＋的，以短鏈狀排列或者是營養(yǎng)肉湯中以長鏈狀排列的細菌，使用鏈球菌細菌生化編碼鑒定管對菌種進行鑒定，每盒10支，共12種。

2.3.3大腸桿菌生化鑒定

將在普通瓊脂培養(yǎng)基上長的比較好的，革蘭氏染色鏡檢結果為G-的，以不大不小的短桿菌形狀排列的，使用腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管對菌種進行鑒定，每盒10支，共11種。

2.4藥敏試驗

藥敏試驗采用紙片擴散法，檢測可以分離得到細菌對藥敏紙片的敏感程度。

2.4.1菌液濃度的調節(jié)

挑取單個菌落接種到有關的營養(yǎng)肉湯中(鏈球菌中要加血清)，通過一定的稀釋來延長培養(yǎng)的時間調節(jié)濃度，將菌液濃度稀釋到一定的程度上，然后放在37℃的恒溫箱里面培養(yǎng)24h。

2.4.2細菌涂布接種和貼藥敏紙片

將培養(yǎng)后的葡萄球菌和大腸桿菌接種到普通的營養(yǎng)瓊脂平板上，鏈球菌接種到血瓊脂平板的表面上，然后用滅菌涂布棒把菌液均勻地涂在平板的表面，待表面稍干燥之后，用無菌攝子夾取有關的抗菌紙片，一定距離貼于平板之上，置室溫中恒溫培養(yǎng)一天。

2.4.3抑菌圈的測量與記錄

用游標卡尺測量抑菌圈的直徑和藥敏紙片的直徑，以1998年中國藥品生物檢定所和衛(wèi)生部制定的細菌耐藥性標準作為判定標準，直徑等于0的為不敏感，直徑小于20mm的是低度敏感，直徑在20mm至28mm之間的為中度敏感，直徑大于28mm的為高度敏感。

3 結果

3.1主要致病菌種類和比例

100份奶樣主要致病菌分離情況統(tǒng)計見表2。

表2 樣品中主要病原菌分離鑒定的結果

通過表2可以看出，在奶牛分泌的乳樣中，金黃色葡萄球菌74株，占細菌總數(shù)的69.16%；無乳鏈球菌27株，占25.23%；大腸桿菌6株，占細菌總數(shù)的5.61%。通過分析可以發(fā)現(xiàn)，在導致奶牛感染乳房炎的主要致病菌中，金黃色葡萄球菌的比例最高，其次是無乳鏈球菌，大腸桿菌最少。

3.2病原菌的感染情況

本次實驗檢測的奶樣中，病原菌單獨感染的概率為48.78%，其中金黃色葡萄球菌的單獨感染的概率高達39.02%;病原菌混合感染的概率高達51.22%，分離的大腸桿菌均是和金黃色葡萄球菌或無乳鏈球菌混合感染。

導致奶牛感染乳房炎的致病菌中，原因主要是單獨感染了金黃色葡萄球菌占細菌總數(shù)的39.02%，單獨感染了無乳鏈球菌占細菌總數(shù)的9.76，總之，48.78%的奶牛是因為單獨感染某一種致病菌導致發(fā)生乳房炎，51.22%的奶牛是因為混合感染了多種致病菌導致發(fā)生乳房炎。由此可以得出結論，一半以上的奶牛感染乳房炎主要是因為混和感染了多種致病菌。

3.3藥敏試驗結果

主要致病菌的藥敏試驗結果見表3。

表3 主要病原菌藥敏試驗結果(表中數(shù)據(jù)為抑菌圈直徑，單位mm)

通過表3可以看出，在本次藥敏試驗中，感染金黃色葡萄球菌的奶牛對青霉素不敏感，對林可霉素和環(huán)丙沙星高度敏感，對先鋒霉素V、阿米卡星、慶大霉素和氟呱酸為中度敏感，對菌必治、利福平、鏈霉素、羅紅霉素、紅霉素、復方新諾明、克林霉素、痢特靈和四環(huán)素低度敏感。感染無乳鏈球菌的奶牛對青霉素也不敏感，對林可霉素和環(huán)丙沙星高度敏感，對先鋒霉素V、利福平、阿米卡星和慶大霉素中度敏感，對菌必治、鏈霉素、羅紅霉素、紅霉素、復方新諾明、氟呱酸、克林霉素、痢特靈和四環(huán)素低度敏感。感染大腸桿菌的奶牛對先鋒霉素V、慶大霉素和林可霉素高度敏感，對氟呱酸、四環(huán)素和環(huán)丙沙星中度敏感。對青霉素、菌必治、利福平、鏈霉素、阿米卡星、羅紅霉素、紅霉素、復方新諾明、克林霉素和痢特靈為低度敏感藥物。

3.4討論

引起奶牛感染病原體的原因有很多，包括各種細菌和病毒，這種情況下，實現(xiàn)對病原微生物的研究就十分重要。通過試驗研究發(fā)現(xiàn)導致奶牛感染乳房炎的主要的致病菌有葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌，其中葡萄球菌和鏈球菌占致病菌總數(shù)的94.39%，大腸桿菌只有5.61%。而且根據(jù)調查研究還可以發(fā)現(xiàn)：如果奶牛被其中一種細菌感染，其自身的免疫力及抵抗力會下降，就更容易被其他的病菌侵害。由此可見，奶牛極有可能是被其中一種病菌侵害，且發(fā)生混合感染的概率更高，高達51.22%。在對感染金黃色葡萄球菌而發(fā)生乳房炎的奶牛進行用藥治療時，需要注意藥物的敏感性，尤其要注意林可霉素和環(huán)丙沙星的用藥，這兩種屬于高度敏感藥物；盡量不使用先鋒霉素V、阿米卡星、慶大霉素和氟呱酸等中度敏感藥物；謹慎使用菌必治、利福平、鏈霉素、羅紅霉素、紅霉素、復方新諾明、克林霉素、痢特靈和四環(huán)素等低敏感度藥物。對感染無乳鏈球菌而發(fā)生乳房炎的奶牛進行用藥治療時，尤其要注意林可霉素和環(huán)丙沙星這兩種高度敏感藥物；盡量不使用先鋒霉素V、利福平、阿米卡星和慶大霉素等中度敏感藥物；謹慎使用菌必治、鏈霉素、羅紅霉素、紅霉素、復方新諾明、氟呱酸、克林霉素、痢特靈和四環(huán)素等低度敏感藥物。在對感染大腸桿菌而發(fā)生乳房炎的奶牛進行用藥治療時，尤其要注意先鋒霉素V、慶大霉素和林可霉素等高度敏感藥物的使用；盡量不使用氟呱酸、四環(huán)素和環(huán)丙沙星等中度敏感藥物；謹慎使用青霉素、菌必治、利福平、鏈霉素、阿米卡星、羅紅霉素、紅霉素、復方新諾明、克林霉素和痢特靈等低度敏感藥物。

另外，本實驗還有一些不足之處 ，主要表現(xiàn)在通過試驗分析只分別得出了金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌的藥物敏感情況，沒有總結出奶?；旌细腥径喾N致病菌導致發(fā)生乳房炎以后，在臨床用藥時應當注意選擇哪些敏感藥物，此后還應進行混合感染后敏感藥物篩選方面的研究，對臨床用藥具有重要的指導意義。