陳 剛，周 謙，王 旻*，顧覺奮*

(1.中國藥科大學生命科學與技術學院，天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇南京 210009;2.江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院心血管科，江蘇南京 210028)

紫杉醇(paclitaxel，商品名taxol)，是一線抗腫瘤藥物，20世紀60年代中期，在太平洋紅豆杉(Taxus brevifolia)樹皮中被發(fā)現(xiàn)，經過30年的研究和臨床試驗，于1992年12月29日，被美國食品藥品管理局(FDA)批準為治療卵巢癌新藥。目前臨床和科研所需的紫杉醇主要是從紅豆杉中直接提取，但是紫杉醇在植物體中平均僅含0.015%，大量砍伐會導致樹種瀕臨滅絕。同時，紫杉醇本身資源很匱乏，且植株生長緩慢，這對紫杉醇的進一步開發(fā)利用造成了很大的困難?；瘜W合成雖已完成，但由于產量低，經費高，不具有產業(yè)化意義。半合成方法雖比較成熟，但需要消耗大量紅豆杉樹木，與直接提取的方法并無本質區(qū)別，仍不能從根本上解決資源匱乏的問題，組織培養(yǎng)法因其成本高而難以大規(guī)模生產。顯然，尋找紫杉醇的新來源具有十分重要的意義。

植物內生真菌(Plant Endophytic Fungi)是指生長于植物組織的內部，分布于葉鞘、種子、花、莖、葉片和根中度過全部或近乎全部生活周期而不引起明顯病害癥狀的一類微生物。內生真菌長期生活在植物體內的特殊環(huán)境中，并與宿主協(xié)同進化，可能產生與宿主相同或相似的具有生物活性的次生代謝產物。1993年美國化學家 Stierle和植物病理學家Strobel最早從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)的韌皮部分離出一株產紫杉醇的內生真菌Taxomyces andreanae，產量約為25～50 ng/L發(fā)酵液體積。此后，各國學者紛紛開展紫杉醇內生真菌的研究工作，陸續(xù)從西藏紅豆杉、云南紅豆杉、歐洲紅豆杉、中國紅豆杉等分離到產紫杉醇的內生真菌，其宿主植物幾乎涉及紅豆杉的各個種。此外，研究人員在與紅豆杉有相同環(huán)境要求的其它植物中也分離到了可產紫杉醇的內生真菌。利用真菌發(fā)酵產紫杉醇與從植物中提取有獨特的優(yōu)勢，真菌不僅能在簡單的培養(yǎng)基上良好生長，產生大量的發(fā)酵產物，還可以在生物反應器中人為控制各種參數(shù)，并可通過誘變育種等手段改變菌種性能以提高紫杉醇產量，因此便于大規(guī)模工業(yè)化生產的實現(xiàn)，前景十分廣闊;而且對于植物來源天然藥物新生成途徑的開發(fā)及瀕危藥用植物的保護具有十分重要的經濟及生態(tài)效益。因此，利用內生真菌生產紫杉醇是解決藥源問題的有效途徑［1］。

圖1 紫杉醇的化學結構

1 產紫杉醇內生真菌的分離與鑒定方法

1.1 產紫杉醇內生真菌的分離與培養(yǎng)方法［2－3］

從宿主植物分離內生真菌主要有兩種方法:⑴標準的真菌分離純化方法。取健壯的植物組織，用清水沖洗干凈，再用75%酒精、0.1%升汞等進行消毒，用無菌水漂洗剩余消毒劑后將外層組織削去，內部組織削成小片，置入添加青霉素或鏈霉素的PDA培養(yǎng)基或水瓊脂培養(yǎng)基中，菌絲長出后，采用尖端菌絲挑取法挑取形態(tài)不同的菌絲置于新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。⑵平板灌注法。將外皮層除去，再用酒精、升汞等消毒，無菌水漂洗，將組織樣品加入適量無菌水中，放入研缽中充分研磨，取勻漿注入融化的PDA培養(yǎng)基中，搖勻，置平板，25℃恒溫培養(yǎng)。待菌絲長出后，挑取其尖端接種至新的培養(yǎng)基上，據此，不斷純化直至純培養(yǎng)，斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基的種類與培養(yǎng)條件的選擇對菌種的生長與代謝產物的積累是非常重要的，目前，常用的培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、察氏培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基及麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基或是與酵母浸膏結合的培養(yǎng)基等。培養(yǎng)溫度與pH值反應自然條件情況，典型的溫度范圍是18～25℃，pH自然。培養(yǎng)過程中還可以通過添加誘導物、代謝產物合成抑制劑及前體物質以促進紫杉醇的積累。常用的誘導物有植物激素、無機離子、多糖、茉莉酸等。通過添加代謝產物合成抑制劑可以抑制其它次級代謝產物的合成，常用的有麥角固醇、酪氨酸、RNA酶抑制劑、硫酸氧礬等。添加前體物質可通過增加底物量來加快反應速度、提高產率，如10－去乙酰巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ等。

1.2 產紫杉醇內生真菌的鑒定［4］

傳統(tǒng)的菌種鑒定是根據菌群的性狀、形態(tài)特征、生長特性及生理生化指標等方面的相近或相異的程度加以歸并或分開，再根據這些菌群相互之間差異的大小和親緣關系遠近的區(qū)別，列為綱、目、科、屬、種等分類單位。如果通過這些處理后還不能查出菌種的歸類，那就以新的種屬來對待。

由于某些真菌的屬、種之間形態(tài)學或生理生化差異極不顯著，而且形態(tài)特征有時會受環(huán)境因素的影響，常規(guī)條件下培養(yǎng)產孢會比較困難，所以采用傳統(tǒng)的分類方法對菌株進行分類鑒定相當困難。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，近年來已形成多種全新的方法，如DNA中的(G+C)%含量測定、核酸雜交技術、限制性酶切片段長度多態(tài)性分析、電泳核型分析、隨機擴增多態(tài)性DNA分析、多位點酶電泳、β－微管蛋白(TB)基因的序列對比等，其中，rDNA序列分析由于快速、簡便及高特異性顯示出了極大的優(yōu)勢，一系列分子標記應用于真菌的分類鑒定中，rDNA是rRNA基因以及與之相鄰的間隔區(qū)的合稱，真核生物的 rDNA序列均有非常明顯的特點，18S，5.8S，28S rDNA基因序列進化緩慢而相對保守，但這3個基因序列之間的ITS序列的進化則相當迅速，所以，可利用其保守區(qū)設計通用引物，對其變異區(qū)進行PCR擴增和對擴增片段測序，然后與DNA序列數(shù)據庫中的已有序列進行對比，通過分析同源性，構建系統(tǒng)進化樹等得到真菌的分類地位，ITS區(qū)序列分析可獲得屬、種間、種內的分類地位廣泛適用于較低分類階元。若只需獲得系統(tǒng)發(fā)育中種級以上的分類地位，則可對18S rDNA或28S rDNA進行分析，其中18S比28S基因更保守，所以更多的用于界、門、綱、目、科、屬、種間的分類分析。目前，在產紫杉醇內生真菌的鑒定中，人們往往采取形態(tài)學與分子生物學相結合的策略，以期最準確的獲得菌種的分類地位。

2 紫杉醇的提取與檢測技術

2.1 紫杉醇的提取

進行提取之前首先要獲得足夠的發(fā)酵產物，先將菌種接至基本培養(yǎng)基上一段時間，獲得足夠菌絲后，再接種至發(fā)酵培養(yǎng)基上積累次生代謝產物。例如Li等［5］將F.mairei K178在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，按5%的接種量接入500 mL的錐形瓶中，170 r/min，25℃培養(yǎng)12 d。也有學者直接利用改良的MID培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，例如Pandi等在每升MID培養(yǎng)基中加入1 g蛋白胨，對菌株Botryodiplodia theobromae Pat.培養(yǎng) 22 d，而后進行紫杉醇的提?。?］。

紫杉醇的提取要全面考慮預處理方法，所用溶劑，濃縮的溫度、壓力等條件。常用有機溶劑，如氯仿、甲醇、乙酸乙酯等。同時，不同的提取方法也會對結果帶來一定影響。Pandi等［7］將發(fā)酵產物過濾除菌絲體，濾液加入Na2CO3，且邊加邊振蕩，以除脂肪酸的污染，用2倍體積的二氯甲烷進行提取，收集有機相，35℃下減壓濃縮，所得固體用甲醇溶解。Chen等則將菌絲體攪拌均勻后，直接用甲醇進行提取，離心并收集上清液，旋轉蒸發(fā)去有機溶劑，加入等體積蒸餾水和次甲基氯化物溶解固體并進行提取，待有機相揮發(fā)后再用甲醇溶解過柱純化。Dai等將發(fā)酵產物進行離心并收集上清液，菌絲體攪拌15～20 min以釋放目標產物，離心，合并兩組上清液，50℃濃縮至原體積的1/3，用氯仿提取，提取物加Na2SO4在35℃下濃縮，所得固體再用甲醇溶解［2］。

2.2 紫杉醇的檢測

真菌發(fā)酵液中紫杉醇的測定可用TLC、HPLC、MTLC、HPLC/LC－MS、MS、微管蛋白依賴的生物化學檢測、受體蛋白介導的生物測定法、免疫分析法、生物活性測定等。通常情況下，樣品的HPLC與標準品停滯時間在誤差范圍內相近，加上質譜分子量譜，可以初步判斷是紫杉醇。若單獨采用HPLC檢測是不足以確定所測樣品就是紫杉醇，因為有些物質具有與紫杉醇相近的滯留時間，如球毛殼甲素、三尖杉寧堿等。HPLC－MS法的主要特點是高速、高壓、高效及高靈敏度，是目前較常用的方法，然而需要對樣品事先處理，工作費時、繁重，且對儀器要求較高，尤其是對活性形式不能有效識別。微管蛋白依賴的生物學方法則不能夠檢測有潛在價值的非活性同源物，如巴卡亭Ⅲ或10－去乙酰巴卡亭Ⅲ?；谑荏w蛋白的生物學測定對紫杉醇具有一定的特異性，而且擁有抗原與抗體反應相似的可逆性，但它不能有效識別紫杉醇類似物及其代謝產物，交叉反應性比較弱僅能對紫衫烷中某一種或某一類有效識別，具有一定的局限性。ELISA檢測通常采用競爭抑制免疫酶分析法(competitive inhibition enzyme immunoassay，CIEIA)，該法是利用對紫杉醇有專一特性的單抗進行測定，簡單易行，靈敏度高，能夠大批量的處理樣品，在檢測極低濃度的紫杉醇時優(yōu)勢更為突出，但費用昂貴，且對紫杉醇和其結構類似物多烯紫杉醇識別率不高。生物學活性檢測有對癌細胞毒性、動物細胞的毒性及卵菌的敏感性等方法。以上方法的聯(lián)合使用，往往更能提供可信的證據［8－9］。

3 產紫衫醇的內生真菌

到目前為止，研究者發(fā)現(xiàn)能產紫杉醇的內生真菌已有20多個屬(部分見表1)，隨著植物內生真菌研究的深入，越來越多的產紫杉醇內生真菌被發(fā)現(xiàn)，這充分說明了產紫杉醇內生真菌的物種多樣性。Kumaran等從日本紅豆杉的葉中分離到的Phomopsis BKH27，紫杉醇產量達到了418μg/L，是最早分離到的產紫杉醇內生真菌Taxomyces andreanae 8360倍，經測試對人腫瘤細胞有很強的細胞毒作用［10］。程首先等以從紅豆杉樹皮中分離得到的高產紫杉醇菌013為出發(fā)菌株，采用紫外線誘變、亞硝基胍誘變交替進行的方法，同時復合含1%乙酰胺的理性化篩選模型，獲得一株遺傳性狀穩(wěn)定的鏈格孢單孢變種ST026，搖瓶發(fā)酵產量可穩(wěn)定達到227000 μg/L，比出發(fā)菌株產量提高81.6%，已進入中試和產業(yè)化研究［11］。Zhang等利用農桿菌介導的遺傳轉化，將農桿菌與產紫杉醇的Cladosporium cladosporioides MD2協(xié)同培養(yǎng)，使紫杉醇合成的限速酶過量表達，發(fā)現(xiàn)對紫杉醇的穩(wěn)定轉化有所幫助［12］。Soliman等將紅豆杉內生真菌Paraconiothyrium SSM001與同樣來源的Alternaria屬內生菌共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)紫杉醇產量達到了原來的3倍，再加入同樣來源的Phomopsis屬內生菌時產量達到原來的8倍，這些結果證明相同植物宿主的內生菌群可以直接或間接地影響紫杉醇的合成［26］。

表1 產紫杉醇的內生真菌(2004年)

4 存在的問題與前景

通過真菌發(fā)酵生產紫杉醇具有明顯的優(yōu)勢，但其產業(yè)化道路并不平坦，還存在著一些亟待解決的重大問題。如產率低是制約產業(yè)化的一個重要因素，產量越高，對細胞的毒害作用就越嚴重，菌株生長速度也就減慢，生長緩慢又限制了紫杉醇的產量。再如產紫杉醇的穩(wěn)定性，據報道產紫杉醇內生真菌Taxomyces andreanae無法重復獲得紫杉醇，可能原因有紫杉醇并非最終產物，不同的培養(yǎng)時間和條件，可能轉化成其它紫杉烷或者被分解。基因組的不穩(wěn)定性也可能導致合成紫杉醇的某些基因的丟失。

解決以上問題可從幾方面入手:一是繼續(xù)從自然界中篩選更好的適合發(fā)酵的原始出發(fā)菌株;二是對現(xiàn)有高產紫杉醇的內生真菌進行菌種改造，以期能夠產生大量菌絲體來提高紫杉醇產量，如誘變育種、原生質體融合、構建基因工程菌等;三是優(yōu)化發(fā)酵工藝，可以采取優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分、添加誘導物、前體物質及代謝產物抑制物等方法。相信隨著研究的深入，紫杉醇合成機制的進一步揭示及一系列基礎問題的解決以生產紫杉醇為目的的微生物產業(yè)途徑前景光明。

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