王兵，劉晴晴，夏春林，劉朝暉

（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部人體解剖與組織胚胎學(xué)系，江蘇蘇州215123）

病毒載體介導(dǎo)β折疊阻斷肽的表達(dá)及其對(duì)β淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性的抑制作用

王兵，劉晴晴，夏春林，劉朝暉

（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部人體解剖與組織胚胎學(xué)系，江蘇蘇州215123）

目的：通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，觀察后者表達(dá)分泌性的β折疊阻斷肽（β-sheet breaker peptide，BSB）的生物活性。方法：采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素4（neurotrophin-4，NT4）信號(hào)肽-BSB融合基因的重組腺伴隨病毒（recombinant adeno-associated vrius，rAAV）載體，AAV在包裝細(xì)胞系293細(xì)胞中進(jìn)行包裝，蔗糖梯度離心法純化病毒顆粒，斑點(diǎn)雜交法測(cè)定重組病毒滴度。MTT檢測(cè)及電鏡觀察BSB的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果：成功構(gòu)建pSSHG/NT4-BSB質(zhì)粒載體，純化后獲得滴度為3.6×1012～1.8×1013/m L的病毒顆粒。通過(guò)病毒感染培養(yǎng)的神經(jīng)元分泌表達(dá)的BSB有效地抑制了β-淀粉樣蛋白（Aβ）的纖維化聚集，明顯降低了Aβ在體外的神經(jīng)元毒性。結(jié)論：采用AAV載體介導(dǎo)的BSB短肽的分泌表達(dá)在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中顯示了良好的生物活性。

阿爾茨海默病；β折疊阻斷肽；信號(hào)肽；腺伴隨病毒

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，同時(shí)也歸為蛋白質(zhì)構(gòu)象?。?］。蛋白質(zhì)構(gòu)象病是一類由于組織中特定的蛋白質(zhì)發(fā)生了構(gòu)象變化進(jìn)而聚集并沉積所引起的疾病。除AD外，帕金森病、亨廷頓病、人海綿狀腦病以及傳統(tǒng)疾病鐮刀型紅細(xì)胞貧血等均屬于蛋白質(zhì)構(gòu)象?。?］。雖然不同構(gòu)象病的臨床和病理表現(xiàn)各異，但共同特征表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與正常相同，而二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；與生理性蛋白質(zhì)相比，異常蛋白質(zhì)中含有較高的β折疊結(jié)構(gòu)，且易聚集形成蛋白質(zhì)低聚化體和聚集體。構(gòu)象病所涉及的變構(gòu)蛋白質(zhì)包括AD中的β-淀粉樣蛋白（Aβ）、帕金森病中的α-突觸核蛋白（α-synuclein）、海綿狀腦病中的朊蛋白以及鐮刀細(xì)胞貧血中的血紅蛋白等［3］。生理狀態(tài)的可溶性Aβ為非淀粉樣的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)象，而病理狀態(tài)則為獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)，即β-折疊構(gòu)象，易集聚，從而產(chǎn)生沉積并引起AD［4］。由此可見(jiàn)，可通過(guò)抑制或者逆轉(zhuǎn)組織蛋白質(zhì)的變構(gòu)來(lái)防治該類疾病，如設(shè)計(jì)一種相關(guān)構(gòu)象的短肽類似物，與蛋白質(zhì)中發(fā)生構(gòu)象改變的核心部位部分同源并結(jié)合，穩(wěn)定靶構(gòu)象的生理結(jié)構(gòu)不向β折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從而抑制Aβ自聚形成聚合體，該短肽類似物稱為β折疊阻斷肽（βsheet breaker peptide，BSB）［5-6］。為此，我們構(gòu)建腺伴隨病毒（adeno-associated virus，AAV）載體重組信號(hào)肽與BSB基因，并通過(guò)AAV載體實(shí)現(xiàn)基因的有效轉(zhuǎn)移和長(zhǎng)期表達(dá)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 Aβ25～35（北京肽合成中心），MTT、低聚賴氨酸（Sigma公司），DMEM、胰蛋白酶（Gibco公司），pGEM-T Easy質(zhì)粒（Promega公司），胎牛血清、Bcl-2抗體、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子抗體及免疫組織化學(xué)染色試劑盒（武漢博士德生物工程公司），E co RⅠ、B am HⅠ限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶（華美生物工程公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取新出生的SD大鼠，無(wú)菌取腦并分離神經(jīng)元。

1.2 設(shè)計(jì)NT4信號(hào)肽-阻斷肽分泌表達(dá)框

將阻斷肽KLVFF與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素4（neurotrophin 4，NT4）信號(hào)肽序列拼接，構(gòu)建重組AAV載體質(zhì)粒pSSHG/NT4-KLVFF。根據(jù)目的序列：NaeⅠ克隆酶切位點(diǎn)-內(nèi)肽酶裂解點(diǎn)-阻斷肽KLVFF序列-終止密碼子TAG-PvuⅡ鑒定酶切位點(diǎn) Bam HⅠ克隆酶切位點(diǎn)（GC-GCCGGC-GTGGG-AAATTGGTGTTCTTT-TAGCAGCTG-GGATCC-CG，兩端各為兩個(gè)保護(hù)堿基）設(shè)計(jì)引物。序列如下：上游引物，GCGCCGGCGTGGGAAATTGGTGTTCTT；下游引物，CGGGATCCCAGCTGCTAAAAGAACACC。T4DNA連接酶連接PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pGEM-T Easy，轉(zhuǎn)鈣化菌、提質(zhì)粒并酶切鑒定，挑選陽(yáng)性pGEM-T/KLVFF克隆，進(jìn)行序列測(cè)定和分析。已構(gòu)建好的pBV220/NT4質(zhì)粒和pGEM-T/KLVFF質(zhì)粒分別用NaeⅠ和Bam HⅠ行雙酶切，得到含黏性末端的pBV220/NT4信號(hào)肽載體和KLVFF目的基因片段，T4DNA連接酶連接，得到NT4信號(hào)肽-內(nèi)肽酶裂解點(diǎn)-阻斷肽KLVFF-終止子的阻斷肽真核分泌專用表達(dá)質(zhì)粒（NT4-KLVFF），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)鈣化菌、提質(zhì)粒并酶切鑒定，挑選陽(yáng)性克隆，最后裝入重組AAV載體質(zhì)粒pSSHG/NT4-KLVFF。

1.3 包裝重組AAV

復(fù)蘇人胚腎293病毒包裝細(xì)胞，至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%成片時(shí)，用磷酸鈣沉淀法將重組質(zhì)粒pSSHG/ NT4-KLVFF、包裝質(zhì)粒pAAV/Ad及腺病毒輔助質(zhì)粒pFG140共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，3 d后收集病毒，蔗糖梯度離心法進(jìn)行純化。

1.4 斑點(diǎn)雜交法確定病毒滴度

取50μL純化的病毒液，加入蛋白酶K溶液降解病毒衣殼蛋白，提取病毒DNA。以確定濃度的標(biāo)準(zhǔn)pSSHG/NT4-KLVFF質(zhì)粒梯度稀釋作為對(duì)照，與提取的病毒DNA梯度稀釋點(diǎn)樣于NC膜上，用合成的地高辛標(biāo)志CMV啟動(dòng)子探針進(jìn)行雜交（PCMV，病毒載體質(zhì)粒pSSHG中采用CMV啟動(dòng)子作為外源基因的啟動(dòng)子），68℃，20 h，地高辛與酶復(fù)合物于37℃作用30 min，顯色液顯色，與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒對(duì)照比較確定病毒DNA濃度。根據(jù)1 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量為635，pSSHG/NT4-KLVFF質(zhì)粒為5.3 kb，則pSSHG/ NT4-KLVFF核酸相對(duì)分子質(zhì)量為5 300×635= 3.37×106，10 ng病毒DNA樣品摩爾量為1×10-8g/3.37×106=3×10-15mol，根據(jù)1 mol為6.02× 1023個(gè)分子，推算10 ng病毒DNA的分子數(shù)目為3× 10-15mol×6.02×1023=1.81×109。

1.5 電鏡觀察分泌表達(dá)的阻斷肽抑制Aβ的纖維化聚集

取新生大鼠的腦并分離出海馬，0.25%胰蛋白酶消化。收集分離的海馬神經(jīng)元并重懸于DMEM中，按1×106/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶。第2天在培養(yǎng)基中加入AAV顆粒進(jìn)行感染，2 d后換液，再次換液時(shí)離心取上清液，微孔濾膜過(guò)濾去除雜質(zhì)，將常規(guī)培養(yǎng)的神經(jīng)元上清液與Aβ40肽混合作為對(duì)照，將分泌表達(dá)阻斷肽KLVFF上清液與Aβ40肽混合，37℃孵育72 h，磷鎢酸負(fù)染，電子顯微鏡下觀察細(xì)胞纖維化狀態(tài)。

1.6 MTT檢測(cè)分析阻斷肽對(duì)Aβ神經(jīng)元毒性的保護(hù)作用

同“1.5”將分離的海馬神經(jīng)元接種于96孔板，24 h后添加阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)元生長(zhǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、Aβ?lián)p傷組和BSB保護(hù)組，BSB保護(hù)組在培養(yǎng)第3天于培養(yǎng)液中加入AAV顆粒感染神經(jīng)元，對(duì)照組和Aβ?lián)p傷組常規(guī)換液；3 d后，BSB保護(hù)組和Aβ?lián)p傷組添加10μL/孔Aβ，使終濃度為20μmol/L。2 d后加MTT，20μL/孔，37℃孵育4 h。每孔加入150μL二甲基亞砜，溶解藍(lán)色結(jié)晶，振蕩，多孔掃描分光光度計(jì)于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值（D）。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 10.0數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，運(yùn)用組間單因素方差分析檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NT4信號(hào)肽-阻斷肽分泌表達(dá)框的設(shè)計(jì)

根據(jù)所需的基因元件及酶切克隆位點(diǎn)，同時(shí)符合開(kāi)放閱讀框（ORF）的原則，設(shè)計(jì)NT4信號(hào)肽-阻斷肽分泌表達(dá)框，見(jiàn)圖1。

圖1 NT4信號(hào)肽-阻斷肽真核分泌表達(dá)框

2.2 KLVFF阻斷肽與NT4信號(hào)肽序列的拼接

將pBV220/NT4質(zhì)粒和pGEM-T/KLVFF質(zhì)粒分別用NaeⅠ和Bam HⅠ雙酶切，連接后得到阻斷肽真核分泌（NT4-KLVFF）專用表達(dá)質(zhì)粒NT4信號(hào)肽-內(nèi)肽酶裂解點(diǎn)-阻斷肽KLVFF-終止子，見(jiàn)圖2。pBV220/NT4-KLVFF質(zhì)粒用Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切鑒定，得到3.63 kb pBV220載體片段和270 bp目的基因片段，用PvuⅡ酶切鑒定，得到3.9 kb線性化基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符。見(jiàn)圖3。

圖2 阻斷肽表達(dá)質(zhì)粒pBV220/NT4-KLVFF的構(gòu)建

2.3 重組AAV載體質(zhì)粒pSSHG/NT4-BSB的構(gòu)建

將pBV220/NT4-KLVFF質(zhì)粒和pSSHG-CMV質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切，得到NT4-BSB基因片段及線性化的pSSHG載體，T4DNA連接酶連接獲得pSSHG/NT4-KLVFF（圖4）。pSSHG/NT4-KLVFF質(zhì)粒用Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖5所示，得到預(yù)期的5 020 bp pSSHG載體片段和270 bp目的基因片段，Bam HⅠ單酶切鑒定，得到5 300 bp線性化基因片段?；蛐蛄袦y(cè)定結(jié)果顯示，NT4-KLVFF與設(shè)計(jì)序列完全相符。

圖3 pBV220/NT4-KLVFF質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

圖4 重組AAV載體質(zhì)粒pSSHG/NT4-BSB

圖5 pSSHG/NT4-BSB質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.4 病毒滴度的斑點(diǎn)雜交結(jié)果

結(jié)果顯示，病毒DNA樣品的顯色深度在pSSHG/NT4-BSB質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的50～100 ng/μL之間（圖6），推算病毒DNA濃度在50～100 ng/μL之間時(shí)病毒數(shù)量為3.6×109～1.8×1010病毒顆粒/ μL，即病毒滴度為3.6×1012～1.8×1013病毒顆粒/mL。

圖6 病毒滴度的DNA斑點(diǎn)雜交結(jié)果

2.5 BSB抗Aβ的神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)

圖7結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Aβ?lián)p傷組存活率明顯降低（t=9.37，P＜0.05）；BSB保護(hù)組細(xì)胞存活率較Aβ?lián)p傷組增高（t=8.45，P＜0.05），顯示了分泌表達(dá)的BSB對(duì)Aβ神經(jīng)元損傷的抑制作用。圖8顯示，Aβ40肽單獨(dú)孵育組孵育7 d后可見(jiàn)Aβ肽凝集形成，以淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)為主；共同孵育組中BSB有效地減少了Aβ40肽的聚集，僅有少量淀粉樣纖維相互聚集，纖維周?chē)殡S大量的無(wú)定形結(jié)構(gòu)，表明分泌表達(dá)的BSB能有效地抑制Aβ的纖維化。

3 討論

AD發(fā)病機(jī)制的中心事件是Aβ以不溶性纖維的形式聚集于細(xì)胞外并沉積形成神經(jīng)炎斑塊［7］。生理情況下，Aβ為可溶性肽，存在于人的體液循環(huán)中并具有正常的生理功能，但在AD患者腦內(nèi)，Aβ含量增高和異常的Aβ增多致其集聚并產(chǎn)生神經(jīng)毒性。Aβ1-42肽的全長(zhǎng)氨基酸序列為DAEFR HDSGY EVHHQ KLVFF AEDVG SNKGA IIGLM VGGVV IA，氨基端為中心疏水區(qū)，第16～20個(gè)氨基酸殘基為KLVFF，是Aβ分子間相互作用的重要部位。在聚集的淀粉樣纖維中，相鄰Aβ肽鏈的KLVFF序列緊密靠攏形成平行或反向平行的β折疊結(jié)構(gòu)。用親水氨基酸取代KLVFF序列的疏水氨基酸顯示Aβ纖維化能力降低；一些可在體外調(diào)節(jié)Aβ淀粉樣聚集物形成的調(diào)節(jié)劑，如金屬離子、蛋白多糖、ApoE等，也是通過(guò)KLVFF序列及鄰近的氨基酸殘基而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［8］。研究表明，五肽配基是識(shí)別結(jié)合序列的最小長(zhǎng)度且能通過(guò)相似的分子間相互作用有效結(jié)合于Aβ，競(jìng)爭(zhēng)性抑制Aβ分子間的結(jié)合，阻止Aβ形成淀粉樣纖維［9］。Tjernberg等［10］和Findeis等［11］等研究證實(shí)，五肽配基KLVFF親和力最強(qiáng)，能抑制纖維形成及其引起的細(xì)胞毒性。阻斷淀粉樣形成的治療方案優(yōu)勢(shì)在于其不影響任何已知的生物學(xué)作用，即不會(huì)干擾正常的組織和細(xì)胞功能［12-13］。

圖7 各組細(xì)胞存活率的比較

圖8 BSB對(duì)Aβ纖維化的抑制作用（電鏡×5 000）

許多生物活性肽的含量極低但生理作用非常強(qiáng)，是多種疾病的良好的臨床治療藥物。但是，肽的人工合成成本高，在體內(nèi)易被分解，生物利用度差，血腦脊液屏障通過(guò)率低，大多數(shù)不能口服需注射給藥。對(duì)此，研究人員在對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病肽類治療藥物的開(kāi)發(fā)中進(jìn)行了多項(xiàng)改善工作，包括進(jìn)行末端保護(hù)、改變手性結(jié)構(gòu)、引入非天然氨基酸等提高穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其半衰期；用多胺對(duì)肽進(jìn)行共價(jià)修飾提高其透過(guò)血腦脊液屏障的能力［14］。本研究中，我們避開(kāi)肽類藥物的結(jié)構(gòu)改造，嘗試使用病毒載體介導(dǎo)短肽基因在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)，以期尋找新的給藥方式使治療短肽能在腦內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)起到治療AD的作用。

Aβ發(fā)生聚集進(jìn)而沉積并產(chǎn)生神經(jīng)毒性主要發(fā)生在細(xì)胞外，那么我們首先需要解決阻斷肽的分泌表達(dá)，致其能夠分泌至細(xì)胞外與Aβ作用。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了NT4信號(hào)肽與BSB融合表達(dá)的策略。NT4信號(hào)肽是NT4成熟肽于胞外分泌表達(dá)時(shí)的一段前導(dǎo)肽，可引導(dǎo)成熟肽出胞并在經(jīng)過(guò)胞膜時(shí)通過(guò)內(nèi)肽酶切點(diǎn)切下信號(hào)肽，從而將成熟肽分泌至胞外。通過(guò)基因序列分析，在NT4內(nèi)肽酶切點(diǎn)前找到了合適的克隆酶切位點(diǎn)NaeⅠ，可將NT4自身序列切下并連入設(shè)計(jì)的外源基因。我們已經(jīng)利用NT4的信號(hào)肽進(jìn)行了多個(gè)肽的分泌表達(dá)，表明NT4的信號(hào)肽序列是一個(gè)非常好的引導(dǎo)短肽分泌到細(xì)胞外的前導(dǎo)序列［15-16］。AAV載體是近年來(lái)采用的高效基因轉(zhuǎn)移載體，幾乎能感染所有組織來(lái)源的分裂和非分裂細(xì)胞，尤其神經(jīng)元這種分化終末細(xì)胞最為常用，可將攜帶的目的基因整合至宿主細(xì)胞的基因組并得以長(zhǎng)期表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)構(gòu)建AAV的阻斷肽分泌表達(dá)載體，成功轉(zhuǎn)染了大鼠海馬神經(jīng)元，BSB的表達(dá)能有效抑制Aβ的纖維化聚集，減輕Aβ對(duì)神經(jīng)元的損傷?；诖耍覀円院髮⑦M(jìn)一步探討AAV介導(dǎo)的BSB分泌表達(dá)在AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中的生物學(xué)作用。

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A viral vector expressing secretoryβsheet breaker peptide inhibited Aβneuronal toxicity

WANG Bing，LIU Qing-qing，XIAChun-lin，LIU Zhao-hui
（Department of Human Anatomy&Histology and Embryology，Medical School of Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123，China）

Objective：To observe biological activity of secretoryβsheet breaker peptide（BSB）expressed via a viral vector in cultured hippocampal neurons.M ethods：We constructed the recombinantadeno-associated virus（rAAV）encoding fusion gene of neurotrophin-4（NT-4）signal peptide and BSB bymolecular cloning technique.The viruswere produced in 293 packaging cell lines of the AAV and purified by sucrose gradient centrifugation.The viral titer was determined by dot blot hybridization.The biological effects of expressive BSB in vitro were observed by MTT assay and electron microscopy.Results：The pSSHG/NT4-BSB plasmid was constructed successfully.The physical titer of recombinant AAV was 1×1011-1×1012virions/mL after purification.The BSB，secretive expression in AAV transfected cultured hippocampal neuron，inhibited Aβfibrosis aggregation and significantly decreased the neurotoxicity of Aβin cultured hippocampal neuron.Conclusion：AAV vectormediated secretive expression of BSB peptide displayed effective biological effect in vitro cultured neurons.

Alzheimer′s disease；β-sheet breaker peptide；signal peptide；adeno-associated virus

R393；R749.16 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A ［文章編號(hào)］ 1671-7783（2015）03-0212-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150051

王兵（1988—），男，碩士研究生；劉朝暉（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：zhliu@suda.edu.cn

2015-03-19 ［編輯］ 劉星星