孫義杰，叢 霞，李華濤，國(guó)曉瞳，陳健偉，趙 園，姜忠玲，王 新，曹榮峰，田文儒

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

小檗堿俗名黃連素，屬于清熱解毒藥，被認(rèn)為是黃連中藥理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。Freile等[2]報(bào)道，小檗堿能有效抑制體外培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌，也能強(qiáng)烈抑制由人體分離出的多種病原真菌和白色念珠菌。但關(guān)于小檗堿在獸醫(yī)臨床治療領(lǐng)域中報(bào)道很少，本試驗(yàn)主要通過(guò)小檗堿以及青霉素、鏈霉素兩種抗生素對(duì)人工誘導(dǎo)的兔乳房炎進(jìn)行臨床治療，測(cè)外周血白細(xì)胞總數(shù)、炎性因子（TNF-α，IL-6）數(shù)量。對(duì)小檗堿治療兔乳房炎作用的研究，可以避免使用抗生素治療產(chǎn)生的耐藥性以及容易復(fù)發(fā)的弊端[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及病料 體重3～4 kg的健康妊娠家兔16只，從青島某兔場(chǎng)采集的病兔乳房炎組織樣用于細(xì)菌培養(yǎng)的棉拭子20份。TNF-α、IL-6 Elisa試劑盒（兔子）和鹽酸小檗堿，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；青霉素，購(gòu)自山東恒信獸藥批發(fā)部；硫酸鏈霉素，購(gòu)自山東中牧獸藥有限公司。

1.2 金黃色葡萄球菌的分離及培養(yǎng) 將采集的病兔乳房組織棉拭子劃線涂于分離培養(yǎng)基中，放入溫箱培養(yǎng)24 h后，取單個(gè)菌落接種于肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取100μL金黃色葡萄球菌接種于肉湯培養(yǎng)基（100 mL），搖床6～8 h，進(jìn)行金黃色葡萄球菌的復(fù)蘇。然后用754型紫外可見分光光度計(jì)在600 nm下選擇OD值在0.08～0.1的菌液，濃度為108CFU/mL，用于人工造兔乳房炎模型。

1.3 抑菌效率測(cè)驗(yàn) 將金黃色葡萄球菌接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取4～5個(gè)直徑大約為1 mm的菌落，溶于1 mL的蒸餾水中，分別取0.1 mL上述菌液于含青霉素及小檗堿的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，分別在37℃培養(yǎng)0、4、14、30 h和48 h時(shí)各取出5 mL的培養(yǎng)物，用營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋100倍后，再分別取出0.1 ml接種于青霉素（青霉素濃度為0.064 IU/mL）和小檗堿1（0.125 mg/mL）和小檗堿2（0.25 mg/mL）的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)的0、4、14、30、48 h后各取出培養(yǎng)物接種于瓊脂培養(yǎng)基，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計(jì)菌落數(shù)（CFU）[4]。

1.4 掃描電鏡觀察 分別向?qū)?shù)期生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)液中加入小檗堿溶液（0.5 mg/mL）、青霉素溶液（40 IU）和鏈霉素溶液（30μg），作用2 h后離心，將沉淀物用2.5%戊二醛固定，再用梯度乙醇脫水，干燥、離子濺射金后，用掃描電鏡觀察。

1.5 試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?、分組及治療 16只體重3～4 kg生長(zhǎng)狀況良好的產(chǎn)仔后7 d泌乳正常的母兔，通過(guò)乳腺注射104CFU/mL的金黃色葡萄球菌懸液1 mL，誘使乳腺發(fā)炎。隨機(jī)分組為A（對(duì)照）組、B（小檗堿）組、C（青霉素）組和D（鏈霉素）組。5 h后分別給兔注射0.8 mL生理鹽水（對(duì)照組），0.8 mL濃度為1.875 mg/mL的小檗堿（小檗堿組），0.8 mL含有16萬(wàn)IU的青霉素（青霉素組），0.8 mL含有10萬(wàn)μg的鏈霉素（鏈霉素組）。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定 在造模前1 h、造模后4、8、12、24 h和36 h分別采四組兔的血液0.5 mL、血清1 mL，進(jìn)行外周血白細(xì)胞總數(shù)以及TNF-α和IL-6測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，采用SPSS軟件13.0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌計(jì)數(shù) 在青霉素作用0、4 h和14 h時(shí)后，金黃色葡萄球菌的數(shù)量在逐漸減少，但是在作用30 h后，細(xì)菌數(shù)量開始增多，表明金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素產(chǎn)生了耐藥性；而在小檗堿作用后的0、4、14、30、48 h時(shí)，金黃色葡萄球菌的數(shù)量直線減少，隨濃度的升高抑菌效果更明顯（圖1），且細(xì)菌對(duì)其未產(chǎn)生耐藥性。

圖1 青霉素和小檗堿作用不同時(shí)間后金黃色葡萄球菌的細(xì)菌計(jì)數(shù)（CFU）

2.2 藥物作用后細(xì)菌的形態(tài)變化 掃描電鏡下，正常金黃色葡萄球菌呈葡萄串狀，排列緊湊，菌體表面光滑，細(xì)胞形態(tài)飽滿（圖2，A）。小檗堿作用2 h后，金黃色葡萄球菌之間聯(lián)接松散，菌體大小不一，表面變得粗糙并有凸起物(圖2，B中箭頭)。青霉素作用2 h后，金黃色葡萄球菌連接松散，菌體皺縮、破裂（圖2，C中箭頭）。鏈霉素作用2 h后，金黃色葡萄球菌連接松散，有極少數(shù)菌體破裂（圖2，D中箭頭）。

2.3 受試兔白細(xì)胞總數(shù) 造模后8 h，對(duì)照組和鏈霉素組兔白細(xì)胞總數(shù)顯著（P＜0.05）高于青霉素組；在造模后8～12 h，青霉素組極顯著（P＜0.01）高于小檗堿組；造模后12～36 h，對(duì)照組和鏈霉素組兔白細(xì)胞總數(shù)極顯著（P＜0.01）高于小檗堿組和青霉素組；在造模后8～24 h，對(duì)照組和鏈霉素組無(wú)顯著性差異；在造模后24～36 h，青霉素組和小檗堿組無(wú)顯著性差異（表1）。

表1 4組兔造模前后白細(xì)胞總數(shù) （×109/L）

圖2 掃描電鏡下金黃色葡萄球菌（正常，A）在小檗堿（B）、青霉素（C）和鏈霉素（D）作用2h后的變化

2.4 受試兔TNF-α和IL-6的含量 在造模后8 h，小檗堿組兔TNF-α的含量極顯著（P＜0.01）高于青霉素組；在造模后12 h，青霉素組顯著（P＜0.05）高于小檗堿組；在造模后36 h，青霉素組極顯著（P＜0.01）高于小檗堿組；在造模后8～36 h，對(duì)照組和鏈霉素組極顯著（P＜0.01）高于小檗堿組和青霉素組，對(duì)照組和鏈霉素組無(wú)顯著性差異。

在造模后12 h，小檗堿組兔IL-6的含量極顯著（P＜0.01）高于青霉素組；在造模后24 h，青霉素組和鏈霉素組顯著（P＜0.05）高于小檗堿組；在造模后36 h，小檗堿組、青霉素組、鏈霉素組無(wú)顯著性差異；在造模后12～36 h，對(duì)照組極顯著（P＜0.01）高于小檗堿組、青霉素組、鏈霉素組（表2和表3）。

表2 四組兔造模前后TNF-α的含量 （pg/mL）

3 討論

細(xì)菌耐藥性的形成與擴(kuò)散已成為抗感染化療面臨的一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，特別是對(duì)多種抗生素具有耐藥性的多重耐藥菌株的形成和日益增多尤使人們深感憂慮。本試驗(yàn)通過(guò)小檗堿與青霉素在體外抑菌試驗(yàn)中對(duì)比，得出小檗堿對(duì)金黃色葡萄球菌有非常好的抑制效果，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制時(shí)間更長(zhǎng)久，且不會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而產(chǎn)生明顯的耐藥性。小檗堿濃度越高，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果越好。

表3 四組兔造模前后IL-6的含量 （pg/mL）

本試驗(yàn)電鏡下對(duì)比小檗堿和青、鏈霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的作用，小檗堿處理過(guò)的菌體大小不一，且表面凹凸不平，青、鏈霉素處理的菌體有的破裂，沒有破裂的大多維持原來(lái)的細(xì)菌形態(tài)?？赡苁怯捎谛￠迚A改變了細(xì)胞壁的通透性、水分進(jìn)入細(xì)菌，使其體積增大，同時(shí)發(fā)生酶外漏[5]，并在細(xì)胞表面聚集。Yi等[6]采用9種有明確抗菌機(jī)制的藥物作為對(duì)照，用HPLC/ESI-MS技術(shù)和主因分析法研究發(fā)現(xiàn)，利福平和諾氟沙星的抗菌機(jī)制與小檗堿十分相似，進(jìn)而推斷小檗堿抑菌時(shí)可能以核酸作為作用靶位。此外，用小檗堿處理時(shí)間越長(zhǎng)，金黃色葡萄球菌表面凸起物越多，菌體皺縮越嚴(yán)重，說(shuō)明小檗堿的抑菌見效慢，需要作用時(shí)間長(zhǎng)。

目前，在臨床上有關(guān)用小檗堿治療兔乳房炎的報(bào)道較少，本試驗(yàn)表明，在治療臨床型兔乳房炎過(guò)程中，無(wú)論從臨床癥狀改善方面還是從血常規(guī)的變化上，小檗堿都有明顯的治療效果，雖然青霉素起效最快，但在血液中維持的時(shí)間較短[7]，且后期藥效降低。小檗堿雖然起效慢于青霉素，但在整個(gè)治療過(guò)程中，小檗堿治療效果穩(wěn)定，且療效更持久。因?yàn)閺慕瘘S色葡萄球菌的形態(tài)變化可推斷，小檗堿與青霉素的抗菌機(jī)制不同。當(dāng)然，小檗堿在臨床上用于治療兔臨床型乳房炎的效果還需進(jìn)一步探討，因?yàn)樾￠迚A是否對(duì)由其他細(xì)菌引起的兔乳房炎有效，是否與其他中藥有效成分或抗生素合用治療效果更好，以及其抑菌機(jī)制如何等，都需要進(jìn)一步研究。

[1]焦利萍.中草藥治療乳癰初期療效觀察[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2007，9（7）：18-19.

[2] Freile M L，Giannini F，Pucci G，et al.Antimicrobial activity of aqueous extracts and of berberine isolated from Berberis hetero?phylla[J].Fitoterapia，2003，74（7-8）：702-705.

[3]李華，劉宏娟，尹秀生.抗生素使用存在的問(wèn)題及分析[J].獸醫(yī)衛(wèi)生，2009，9：38.

[4]朱以勇，王和.抗生素對(duì)耐藥菌生長(zhǎng)繁殖影響的觀察[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2002，14（4）：207-208.

[5]劉體全，郝勇，陳興.氮酮抑菌機(jī)理的研究[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志，1998，15（1）：15.

[6]Yi Z B，Yu Y，Liang Y Z，et al.Evaluation of the antimicrobial mode of berberine by LC/ESI-MS combined with principal compo?nent analysis[J].JPharm.Biomed Anal，2007，44：301-304.

[7]張秀英，叢霞，王新.酸性藥物對(duì)兔體內(nèi)青霉素G鈉藥動(dòng)學(xué)及組織分布的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2000，26（7）：58-59.