文道林 余敏君 游曉星 李冉輝 陳列松 朱翠明 李媛媛 曾焱華

支原體脂肽經(jīng)EGFR/MMP-9誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞分泌MUC5AC

文道林 余敏君 游曉星 李冉輝 陳列松 朱翠明 李媛媛 曾焱華

目的 觀察支原體巨噬細(xì)胞活化脂肽-2（MALP-2）誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞分泌粘蛋白MUC5AC的分子機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292，分別采用0、0.1、1.0和5.0μg/mL MALP-2刺激NCI-H292細(xì)胞24h，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)培養(yǎng)上清中MUC5AC和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的含量；Western blot檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）磷酸化水平。同時(shí)采用EGFR抑制劑AG-1478或MMP-9抑制劑（MMP-9 Inhibitor I）處理細(xì)胞，觀察其對(duì)MUC5AC分泌的影響。結(jié)果 NCI-H292細(xì)胞未刺激時(shí)，MUC5AC以及MMP-9分泌水平極低。當(dāng)給予0.1～5μg/mL MALP-2作用18h后，MUC5AC的分泌水平顯著增高。此外，5μg/mL MALP-2作用NCI-H292細(xì)胞1h后可誘導(dǎo)EGFR磷酸化。采用AG-1478預(yù)處理細(xì)胞1h后，MMP-9及MUC5AC分泌水平明顯減少，同時(shí)，采用10nmol/L MMP-9抑制劑處理后也能下調(diào)MUC5AC水平。結(jié)論 支原體MALP-2經(jīng)EGFR/MMP-9誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞分泌MUC5AC。

支原體巨噬細(xì)胞活化脂肽2；基質(zhì)金屬蛋白酶9；MUC5AC

黏液是分布于氣道表面的一層粘彈性凝膠，它和纖毛共同形成黏液纖毛運(yùn)輸系統(tǒng)，是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1]。雖然黏液對(duì)拮抗病原微生物感染發(fā)揮重要作用，但病理?xiàng)l件下氣道黏液過(guò)度分泌對(duì)影響?zhàn)つだw毛的清除功能。臨床多種疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、囊性纖維化和支氣管擴(kuò)張，往往伴隨有黏液的過(guò)度分泌，從而加重疾病的病情[2-4]。氣道黏液的主要成分是水、離子和粘蛋白組成（其中粘蛋白約占2%）。粘蛋白是由位于上皮杯狀細(xì)胞和黏膜下層腺體中的黏液細(xì)胞分泌。目前已經(jīng)鑒定的粘蛋白基因至少有12種，其中以MUC5AC最重要[5]。肺炎支原體是引起社區(qū)獲得性肺炎最常見(jiàn)的病原微生物，在多種慢性呼吸系統(tǒng)疾病如哮喘中發(fā)揮重要作用。研究表明，肺炎支原體感染后，可上調(diào)氣道上皮細(xì)胞分泌MUC5AC[6]，但其分子機(jī)制尚未完全明了。本研究以支原體巨噬細(xì)胞活化脂肽2（macrophage-activating lipopeptide-2，MALP-2）為研究對(duì)象，觀察其處理NCI-H292細(xì)胞后，對(duì)MUC5AC分泌有何影響，并初步探討其調(diào)控機(jī)制，從而進(jìn)一步明確支原體的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清為Invitrogen公司產(chǎn)品（Frederick，MD）；人基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳欣博盛生物有限公司，人MUC5AC ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。鼠抗人磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）抗體以及total-EGFR抗體購(gòu)自Cell signaling（Beverly，MA）。AG1478和基質(zhì)金屬蛋白酶-9抑制劑購(gòu)自Calbiochem（Darmstadt， Germany）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 人氣道上皮細(xì)胞系NCI-H292用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)豐度達(dá)到70%時(shí)，將其接種至無(wú)血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24h以同步細(xì)胞周期。MALP-2刺激前將NCI-H292接種至24孔板中（細(xì)胞數(shù)約5×105），加入終濃度為0、0.1、1.0和5.0μg/mL MALP-2刺激0～4h或24h，隨后獲取上清或提取總蛋白用于下一步研究。

1.3 MMP-9和MUC5AC檢測(cè) 細(xì)胞處理結(jié)束后，通過(guò)反復(fù)凍融以裂解細(xì)胞。經(jīng)1000r/min離心5min后，棄沉淀，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)上清中

MMP-9和MUC5AC的含量。操作方法按照試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行。結(jié)果以相對(duì)含量表示（處理組吸光值/對(duì)照組吸光值×100%）。

1.4 EGFR磷酸化分析 細(xì)胞處理結(jié)束后，采用預(yù)冷PBS洗滌1次，隨后加入100μL裂解液[50mmol/L Tris（pH7.4），150mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS，1μL蛋白酶抑制劑，1μL磷酸酶抑制劑以及1μL PMSF]冰上裂解15min。4℃離心獲取上清，測(cè)定蛋白濃度后，獲取40μg蛋白用于凝膠電泳。隨后通過(guò)電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，分別與抗磷酸化EGFR抗體（1∶1000）和EGFR抗體（1∶1500）孵育。充分洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，ECL顯影、拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MALP-2誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞EGFR磷酸化NCI-H292細(xì)胞未經(jīng)MALP-2刺激時(shí)，EGFR磷酸化水平極低。當(dāng)給予MALP-2刺激0～4h后，細(xì)胞內(nèi)磷酸化EGFR含量顯著增多，而對(duì)細(xì)胞內(nèi)EGFR總量無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖1。

圖1 MALP-2作用不同時(shí)間對(duì)NCI-H292細(xì)胞EGFR磷酸化的影響

2.2 MALP-2誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌MMP-9 當(dāng)給予0.1、1.0、5.0μg/mL MALP-2作用24h后，可顯著誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌MMP-9，且隨著MALP-2濃度的增加，MMP-9的分泌水平進(jìn)一步增多。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度MALP-2誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌MMP-9

2.3 EGFR抑制劑處理下調(diào)MALP-2誘導(dǎo)分泌MMP-9 NCI-H292細(xì)胞在MALP-2處理前，首先用5～10μmol/ L EGFR AG-1478預(yù)處理細(xì)胞1h，隨后再用MALP-2刺激24h，AG-1478處理后，MMP-9分泌水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 AG-1478抑制MALP-2誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌MMP-9

2.4 抑制MMP-9活性后降低MUC5AC的分泌5μg/mL MALP-2作用NCI-H292細(xì)胞后，可顯著誘導(dǎo)其分泌MUC5AC。而給予10nmol/L MMP-9抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后，MUC5AC含量顯著減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 MMP-9抑制劑下調(diào)MALP-2誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌MUC5AC

3 討論

肺炎支原體是導(dǎo)致兒童及成人呼吸系統(tǒng)感染最常見(jiàn)的病原體，并與多種疾病的急性發(fā)作有關(guān)，如哮喘與COPD。雖然病毒感染是導(dǎo)致哮喘急性發(fā)作的重要因素，但該病也與隨后引起的肺炎支原體二重感染有關(guān)[7]。在這些疾病的急性發(fā)作時(shí)，粘蛋白的過(guò)度分泌是重要的病理學(xué)特征。本研究證實(shí)支原體致病物質(zhì)MALP-2可通過(guò)EGFR/MMP-9通路誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌MUC5AC，這可能是支原體導(dǎo)致多種慢性肺部疾病急性發(fā)作的重要致病因素。

研究表明，MMPs參與多種慢性氣道疾病，如COPD、哮喘和囊性纖維化的發(fā)病過(guò)程，尤其是在氣道炎癥反應(yīng)中，MMP-9發(fā)揮重要作用[8]。然而，以往的研究大多局限于MMPs對(duì)氣道重塑和肺實(shí)質(zhì)的破壞作用[9]，而MMPs對(duì)粘蛋白高分泌的調(diào)控作用和機(jī)制并不完全清楚。本研究通過(guò)ELISA證實(shí)，MALP-2處理NCI-H292細(xì)胞后，可顯著誘導(dǎo)其分泌MMP-9。MMPs異常分泌后可引起細(xì)胞外基質(zhì)降解從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的異常，如導(dǎo)致血管通透性增加和炎性細(xì)胞的滲出等?；罨腗MP-9可降解的細(xì)胞表面相關(guān)分子而產(chǎn)生具有活性的生物成分，并可以通過(guò)裂解細(xì)胞-細(xì)胞之間黏附蛋白來(lái)影響細(xì)胞的行為[10]。本研究結(jié)果顯示，MALP-2處理后可誘導(dǎo)EGFR磷酸化，而NCI-H292細(xì)胞給予EGFR抑制劑處理后，MMP-9的分泌水平顯著降低，表明MMP-9的分泌與EGFR的磷酸化有關(guān)。隨后的研究也證實(shí)MALP-2可上調(diào)MUC5AC的表達(dá)，而給予MMP-9抑制劑處理后，MUC5AC的含量明顯減少，表明MMP-9參與了MUC5AC的分泌。在本研究中，我們并未對(duì)EGFR相關(guān)配體進(jìn)行檢測(cè)，MMP-9誘導(dǎo)MUC5AC的分泌可能是通過(guò)MMP-9降解細(xì)胞表面相關(guān)EGFR的配體分子，或釋放一些相關(guān)生物活性物質(zhì)而最終誘導(dǎo)MUC5AC的合成。此外，MALP-2是TLR2和TLR6的配體。MALP-2經(jīng)TLR2/6識(shí)別后，可上調(diào)一系列細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，而這些炎性因子也可能誘導(dǎo)粘蛋白的表達(dá)[11]。

總之，本研究證實(shí)MALP-2通過(guò)EGFR/MMP-9誘導(dǎo)MUC5AC分泌，因此，MMP-9除了具有損傷肺泡、氣道重構(gòu)以及降解細(xì)胞外基質(zhì)外，同時(shí)也能上調(diào)粘蛋白的分泌。在隨后的研究當(dāng)中，我們將對(duì)EGFR的上游通路開(kāi)展研究，從而進(jìn)一步明確肺炎支原體的致病機(jī)制。

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Objective To investigate the molecular mechanism of the Macrophage-activating lipopeptide-2 (MALP-2) on secretion of MUC5AC in human airway epithelial cells. Methods The airway epithelial cell line NCI-H292 was cultured in vitro and stimulated with 0, 0.1,1.0 and 5.0 μg/ mL of MALP-2 for 24h. Secretion of MUC5AC and matrix metalloprotein-9 (MMP-9) in the supernatant were detected by ELISA; Phosphorylation of epithelial growth factor receptor (EGFR) was measured by Western blot. To observe the effect of EGFR and MMP-9 on the mediation of MUC5AC secretion, specific inhibitor AG-1478 and MMP-9 Inhibitor I was used before MALP-2 stimulation. Results The secretion level of MUC5AC and MMP-9 was very low in untreated cells. 0.1-5μg/mL of MALP-2 incubation for 18h signifi cantly upregulated MUC5AC secretion. In addition, 5μg/mL MALP-2 could induce EGFR phosphorylation after 1h of incubation. Treatment of AG-1478, an inhibitor of EGFR, signifi cantly abrogated MALP-2-induced MMP-9 and MUC5AC secretion. Furthermore, 10nmol/L MMP-9 inhibitor could also inhibit MUC5AC production. Conclusion Mycoplasma MALP-2 induces MUC5AC secretion via the EGFR/MMP-9 pathways in human airway epithelial cells

Macrophage-activating lipopeptide-2; Matrix metalloprotein-9; MUC5AC

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.28.001

國(guó)家自然科學(xué)基金 （31370207）

湖南 421001 南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所 （文道林 余敏君 游曉星 李冉輝 陳列松 朱翠明 李媛媛 曾焱華） 廣東 518106 深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院 （文道林） 湖南 422000 邵陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 （李媛媛）

曾焱華 E-mail：zengyihua21cn@126.com