阮光萍，劉菊芬，王金祥，何潔，楊建勇，潘興華

雞卵清提取液促進(jìn)C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的研究

阮光萍，劉菊芬，王金祥，何潔，楊建勇，潘興華

目的研究雞卵清提取液是否有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用。方法分離培養(yǎng)C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并用細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基、PBS、HBSS和雞卵清提取液不同終濃度、不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果雞卵清提取液在不同終濃度、培養(yǎng)不同時(shí)間條件下，對(duì)細(xì)胞的促增殖作用都大于培養(yǎng)基、PBS和HBSS。結(jié)論雞卵清提取液能促進(jìn)C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。

雞卵清；C57小鼠；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；增殖

在細(xì)胞生物學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)一種提取液有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的研究有重要意義。到目前為止，有一些關(guān)于雞卵清提取液的研究報(bào)道，但還沒有報(bào)道雞卵清提取液有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[1-5]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，雞卵細(xì)胞提取液（卵清、全卵）有維持和增強(qiáng)細(xì)胞活性的作用[6]；繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，雞卵清提取液起關(guān)鍵作用，而且獲取方便，獲得的提取液可在4℃穩(wěn)定存放1個(gè)月以上，無需過濾除菌就能用于細(xì)胞培養(yǎng)。在本研究中，我們用C57小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）來進(jìn)一步驗(yàn)證雞卵清提取液對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞是否有促增殖作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備DMEM-F12培養(yǎng)基和青鏈霉素雙抗是Hyclone公司產(chǎn)品，胎牛血清是BI公司產(chǎn)品，細(xì)胞活力試劑盒（CellTiter 96 Aqueous OneSolution Cell Proliferation Assay）是Promega公司產(chǎn)品。其他試劑為國產(chǎn)分析純，均在有效期內(nèi)使用。細(xì)胞培養(yǎng)箱是上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。SPF級(jí)C57小鼠5只，體重18~22 g，出生6~7 w，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京) 2009-0004]。

1.2 雞卵清提取液制備取5個(gè)購自超市雞蛋，無菌分離卵清和卵黃，卵清按1∶1加裂解液，充分?jǐn)噭颍瑑鲇?20℃，反復(fù)凍融3次后，4600 r/min離心10min，取上清，4℃保存。裂解液配方：50mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L HEPES，pH 8.2，1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)、0.1 mmol/L、苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制劑。由此得到的提取液為雞卵清提取液。在提取過程中注意無菌操作，提取獲得的雞卵清提取液無需再過濾除菌即可用于細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3 C57小鼠BMSC培養(yǎng)C57小鼠頸椎脫臼處死，無菌取股骨，用生理鹽水沖洗，用青鏈霉素雙抗浸泡，用滅菌的小剪刀剪去股骨兩端，用1 m l注射器吸培養(yǎng)基將股骨中的細(xì)胞沖出，然后離心，棄上清，用20%FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；第2 d換液，以后每3~5 d換液，換液2~3次后，可見呈梭形貼壁生長(zhǎng)的BMSC。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，可傳代，第3代細(xì)胞用于增殖實(shí)驗(yàn)。

1.4 增殖實(shí)驗(yàn)將第3代C57小鼠BMSC消化下來，計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/ml，加入96孔板，四周的孔每孔加100μl PBS，可有效地防止蒸發(fā)。中間還剩6排，每排10孔。第1排每孔加50μl培養(yǎng)基，第2排每孔加50μl PBS，第3排每孔加50μl HBSS，第4排每孔加50μl雞卵清提取液。要使加入的PBS、HBSS和雞卵清提取液的終濃度分別為20%、25%和40%。在加之前用培養(yǎng)基調(diào)PBS、HBSS和雞卵清提取液的濃度分別為40%、50%、80%，而用原液加入后，則終濃度為50%。培養(yǎng)不同時(shí)間后，每孔加入Promega的MTS試劑20μl，3 h后490 nm比色。

2 結(jié)果

2.1 C57小鼠BMSC的形態(tài)換液幾次后，在倒置顯微鏡下可見C57小鼠BMSC呈梭形貼壁（圖1A）。細(xì)胞長(zhǎng)滿后可傳代（圖1B）。

圖1 C57小鼠BMSC的形態(tài)

2.2 不同培養(yǎng)條件下BMSC增殖能力檢測(cè)結(jié)果不同終濃度雞卵清提取液與C57-BMSC共培養(yǎng)不同時(shí)間后，對(duì)細(xì)胞的促增殖作用都大于培養(yǎng)基、PBS和HBSS。見表1。

3 討論

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)雞卵清獲取方便，無菌提取后，無需過濾除菌就能用于細(xì)胞培養(yǎng)。本研究用細(xì)胞增殖試劑盒對(duì)比平衡鹽（PBS和HBSS）、培養(yǎng)基和雞卵清提取液對(duì)細(xì)胞增殖的不同作用，檢測(cè)它們對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明，在不同終濃度、不同培養(yǎng)時(shí)間條件下，雞卵清提取液促C57小鼠BMSC增殖的作用都比培養(yǎng)基的作用強(qiáng)，證明了雞卵清提取液有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用，在20%、25%、40%和50%終濃度時(shí)，培養(yǎng)2 d或3 d都促進(jìn)細(xì)胞增殖，作用都比培養(yǎng)基強(qiáng)（P＜0.01），提示可將雞卵清提取液作為間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的添加劑，有效地促進(jìn)C57小鼠BMSC增殖。

在檢測(cè)細(xì)胞增殖活性時(shí)，本研究采用進(jìn)口的Promega細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，不像傳統(tǒng)的MTT方法，操作步驟麻煩耗時(shí)、影響因素多。而進(jìn)口的Promega細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒只需一步，即每孔加入20μl試劑，不需吸掉上清，也不需振蕩溶解沉淀，在37℃放置1~4 h就可以比色，所獲結(jié)果比傳統(tǒng)的MTT法更具有可比性。為了防止96孔板的邊緣效應(yīng)，我們用100μl PBS加到四周的孔中，可以有效防止蒸發(fā)，使結(jié)果更具可比性。

總之，雞卵清提取液添加到培養(yǎng)基后，細(xì)胞增殖活性強(qiáng)于普通培養(yǎng)基，證明了雞卵清提取液有可能成為一種間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中的有效添加劑，促進(jìn)細(xì)胞活性與增殖。

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表1 不同培養(yǎng)條件下BMSC增殖能力檢測(cè)結(jié)果(n=10)

[5]Lin FJ,You LR,Yu CT,et al.Endocardial cushion morphogenesis and coronary vessel development require chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factorⅡ[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(11):e135-146.

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Extract from chicken ovalbumin promotes proliferation of C57mouse bonemarrow mesenchymal stem cells

Ruan Guangping,Liu Jufen,Wang Jinxiang,He Jie,Yang Jianyong,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/The Nation and Region Integrated Engineering Laboratory of Stem Cell and Immunocyte Biological Technology/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To investigate whether the extract from chicken ovalbumin has the promotion effect on themesenchymal stem cell proliferation.Methods C57mouse bonemarrowmesenchymal stem cellswere isolated and cultured.Cell proliferation assay kitwas used to detect the effects of culturemedium,PBS,HBSS,and chicken ovalbumin extractwith different final concentration and different culturing time on cell proliferation.Results Under the conditions of different final concentration and different culturing time,chicken ovalbumin extract had a greater effect on cell proliferation than the culturemedium,PBS,and HBSS.Conclusion Extract from chicken ovalbumin can promote the proliferation of C57mouse bonemarrowmesenchymal stem cells.

chicken ovalbumin extract;C57mouse;bonemarrow mesenchymal stem cell;proliferation

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0826-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.005

2015-03-26）

國家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB5181060）；國家自然科學(xué)基金(31172170)；昆明市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(昆科字2012AR070008)

650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室

潘興華,E-mail:xinghuapan@aliyun.com