朱向情，蔡學(xué)敏，王強(qiáng)，沈麗蓉，朱光旭，龐榮清，潘興華

體外誘導(dǎo)體細(xì)胞逆分化為多能干細(xì)胞及對老年猴的影響

朱向情，蔡學(xué)敏，王強(qiáng)，沈麗蓉，朱光旭，龐榮清，潘興華

目的探討誘導(dǎo)自體外周血單個(gè)核細(xì)胞逆向分化為多能干細(xì)胞樣細(xì)胞的方法及誘導(dǎo)細(xì)胞對老年獼猴衰老相關(guān)血液生化指標(biāo)的影響。方法利用魚卵母細(xì)胞提取物與體外共培養(yǎng)法誘導(dǎo)獼猴外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞樣細(xì)胞，采用靜脈回輸?shù)姆椒?，將該?xì)胞回輸給20～24周歲的老年獼猴，檢測并比較回輸前后獼猴的體重、血常規(guī)以及超氧化物歧化酶（SOD）等指標(biāo)的變化。結(jié)果與自體誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞回輸前相比，回輸后3個(gè)月，獼猴體重?zé)o明顯變化，外周血中SOD的活力和血小板的數(shù)量顯著升高，血Na+、K+、CO2、AG含量顯著升高，肌酐、尿酸、LDL-膽固醇含量顯著降低。結(jié)論魚卵細(xì)胞提取物可誘導(dǎo)部分外周血單個(gè)核細(xì)胞逆向分化為多能干細(xì)胞樣細(xì)胞，該細(xì)胞能夠顯著改善與衰老相關(guān)的血液生化指標(biāo)。

獼猴；誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞；生化指標(biāo)；成體細(xì)胞；抗衰老

誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞是近年來生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重大技術(shù)突破。自2006年以來，科學(xué)家利用轉(zhuǎn)Oct4、Kif4、Sox2、c-Myc基因法，成功將人和鼠的成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）[1-2]。還有人利用蛋白轉(zhuǎn)染和化學(xué)物質(zhì)、microRNAs誘導(dǎo)等方法誘導(dǎo)血細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等成體細(xì)胞重編程為iPSC[3-4]。上述方法獲得的iPSC均具有類似胚胎干細(xì)胞的強(qiáng)大分化潛能，可能成為干細(xì)胞治療技術(shù)發(fā)展的新來源，但目前尚存在諸多技術(shù)問題。2010年，本課題組利用魚卵母細(xì)胞提取物成功誘導(dǎo)人和鼠的體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞樣細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)iPSC的部分標(biāo)志性抗原，體內(nèi)外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有分化為神經(jīng)、肌肉、血管、骨等多種成熟細(xì)胞的能力，初步命名為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced multipotent stem cell,iMSC）[5-6]。為證實(shí)該iMSC的生物學(xué)功能，本研究利用魚卵細(xì)胞提取物誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞逆向分化為iMSC，并探討了iMSC對老年獼猴衰老相關(guān)血液生化指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），新生牛血清（美國Gibco公司），雙抗（美國Hyclone公司），檸檬酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），Nacl（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），超氧化物歧化酶測試盒（南京建成），淋巴細(xì)胞分離液（南京建成），百萬級層流超凈工作臺(tái)（SW-CL-2F型，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司），百級層流超凈工作臺(tái)（吳江市綠鳥凈化設(shè)備廠），倒置相差顯微鏡（BX60型，日本奧林巴斯），LEICA RM2135組織切片機(jī)（德國萊卡）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理選擇年齡為20~24周歲、體重為5~8 kg的健康獼猴10只（雌猴和雄猴各5只），由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有獼猴均按照正常條件飼喂和飲水。

1.3 魚卵細(xì)胞提取物的制備選擇卵母細(xì)胞卵黃充滿時(shí)相的昆明當(dāng)?shù)禺a(chǎn)鯽魚，用75%的酒精浸泡15~20 min，在無菌條件下，取出魚卵，用研缽將其磨碎，按體積約1∶1的比例加入生理鹽水，1000 r/min離心10 min，然后3000 r/min離心10 min，取上清，過濾除菌。采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測定蛋白含量，用DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋成10mg/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離及誘導(dǎo)處理無菌條件下抽取實(shí)驗(yàn)猴外周血20 ml，加入等量的Hank液后混勻，小心加入到淋巴細(xì)胞分離液之液面上，以2500 r/min離心15 min，收集淋巴細(xì)胞層；放入含Hank液試管中，充分混勻后，以1500 r/min離心10 min。吸棄上清液，沉淀經(jīng)反復(fù)洗2次，即得所需細(xì)胞。

將分離到的單個(gè)核細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為約（2~5）×105個(gè)/ml，接種于含有DMEM/F12培養(yǎng)基的75 cm2的培養(yǎng)瓶中，添加魚卵細(xì)胞提取物至終濃度為0.24mg/ml。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2、90%濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h更換培養(yǎng)液及誘導(dǎo)劑，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后離心收集細(xì)胞。

1.5 誘導(dǎo)細(xì)胞回輸將誘導(dǎo)處理72 h并鑒定后的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，并按照5×106個(gè)細(xì)胞/kg靜脈回輸給實(shí)驗(yàn)猴。每月回輸1次，共回輸3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表型收集不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72 h）的細(xì)胞，置于流式分析管中，加入4ml PBS，1800 r/min離心5min，棄上清，然后加入4 ml PBS，重復(fù)上述操作3次進(jìn)行細(xì)胞清洗。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為約1×106個(gè)/100μl，每個(gè)分析管中分別加入標(biāo)記抗體（OCT4、CD3、CD34、SSEA4、Nanog、C-myc），輕輕吹打混勻，4℃避光孵育30 min，然后加4 ml PBS，1800 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)3次，加500μl PBS，輕輕吹打混勻后，按流式細(xì)胞分析要求進(jìn)行分析檢測。

1.7 超氧化物歧化酶（SOD）的活力測定細(xì)胞回輸前和每次細(xì)胞回輸后1個(gè)月，采集老年獼猴外周血，采用超氧化物歧化酶測試盒檢測SOD活力，操作方法見表1。

表1 超氧化物歧化酶活力測定方法

1.8 血液生化指標(biāo)檢測于實(shí)驗(yàn)前和細(xì)胞回輸3次后，分別采集實(shí)驗(yàn)猴外周血，送本院檢驗(yàn)科分別檢測血小板數(shù)量及Na+、K+、CO2、AG、肌酐、尿酸、LDL-膽固醇含量，取3次結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果

2.1 魚卵提取物蛋白含量根據(jù)蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白OD值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得直線回歸方程為：y=0.7286x+0.0001，R2=0.9998。魚卵母細(xì)胞提取物總蛋白含量利用該蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定，總蛋白含量為40mg/ml。將魚卵母細(xì)胞提取物稀釋成總蛋白含量為10mg/ml的溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 誘導(dǎo)后的細(xì)胞表型魚卵細(xì)胞提取物誘導(dǎo)處理外周血單個(gè)核細(xì)胞至0、24、48、72 h時(shí)，經(jīng)流式細(xì)胞分析，表達(dá)CD34、CD3、OCT4、SSEA-4、Nanog、C-myc的細(xì)胞比例隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加（圖1）。

圖1 誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞相關(guān)抗原表達(dá)比例

2.3 體重變化誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞回輸前及3次回輸后1個(gè)月，實(shí)驗(yàn)猴體重分別為(6.170±0.956)kg、(6.390±0.936)kg、(6.490±1.124)kg、(6.590±0.860)kg，體重雖呈增加趨勢，但是差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 超氧化物歧化酶活力與回輸前相比較,誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞回輸1、2、3次后，實(shí)驗(yàn)猴血清中的SOD活力均顯著升高（P＜0.05），分別為72.59± 30.39、115.07±5.63、114.15±10.10、106.42±10.95，但多次回輸誘導(dǎo)細(xì)胞與回輸1次之間無明顯差異（P＞0.05）。

2.5 外周血血小板數(shù)量變化誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞回輸3次后，外周血中的血小板數(shù)量、血小板壓積、平均血小板體積均顯著高于回輸前（P＜0.05，表2）。

表2 細(xì)胞回輸前后血小板的變化

2.6 外周血回輸前后生化指標(biāo)的變化誘導(dǎo)細(xì)胞回輸3次后，血液中Na+、K+、CO2和陰離子間隙等指標(biāo)與回輸前均顯著升高，而肌酐、尿酸和LDL-膽固醇均顯著降低。見表3。

表3 細(xì)胞回輸前后生物化學(xué)指標(biāo)的變化

3 討論

衰老是人生命過程中一種無法回避的自然現(xiàn)象，延緩或逆轉(zhuǎn)衰老是醫(yī)學(xué)研究的重大課題和美好愿望，但迄今為止，尚未找到理想方法。研究發(fā)現(xiàn)，年輕鼠的血液或干細(xì)胞可使老年鼠變年輕，包括改善神經(jīng)、肌肉、腎功能和減少骨組織的鈣流失等[7-9]。2010年，本研究課題組利用卵母細(xì)胞提取物誘導(dǎo)人和鼠成體成纖維細(xì)胞重編程為具有多潛能分化能力的細(xì)胞——iMSC，該細(xì)胞在制備過程中不涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)和人工合成的化學(xué)小分子物質(zhì)，不改變重編程細(xì)胞的基因組成和結(jié)構(gòu)，也減少了化學(xué)物質(zhì)對基因組的損傷。本研究旨在探討是否可利用卵細(xì)胞提取物誘導(dǎo)獼猴外周血單個(gè)核細(xì)胞重編程為iMSC，以及該細(xì)胞是否具有改善老年獼猴衰老狀態(tài)的作用。

SOD是一種生命活性物質(zhì)，能夠有效清除新陳代謝過程中自由基的產(chǎn)生，防止自由基對機(jī)體的損傷，延緩機(jī)體衰老[10]。本研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)細(xì)胞回輸后，SOD的活性與回輸前相比顯著升高，表明獼猴體對自由基的清除能力提升，但多次回輸誘導(dǎo)細(xì)胞后SOD活力并沒有顯著提高，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

有研究報(bào)道，老年人血小板數(shù)量減少，血小板的黏附和凝集能力升高，凝血功能亢進(jìn)，促進(jìn)血栓的形成。本研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞回輸后與回輸前相比，獼猴血小板數(shù)量、血小板壓積、平均血小板體積均顯著升高，提示誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的回輸具有預(yù)防血栓形成的作用。

腎臟是人體最重要的代謝器官之一。研究表明[11]，衰老腎臟的保鈉能力降低，代謝和排泄廢物的能力下降，引起機(jī)體鈉水平降低和肌酐、尿酸等含量升高。本研究結(jié)果顯示，回輸誘導(dǎo)細(xì)胞3次后，血液中的鉀離子和鈉離子水平均呈不同程度的升高，血中肌酐和尿酸水平均顯著下降，提示該誘導(dǎo)細(xì)胞可改善衰老獼猴的腎功。

LDL-膽固醇含量是評估罹患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)重要指標(biāo)，過高的LDL-膽固醇容易沉積在血管壁上，形成粥樣硬化，造成血管壁傷害。本研究結(jié)果顯示，自然衰老獼猴3次回輸誘導(dǎo)細(xì)胞后，LDL-膽固醇含量顯著降低，表明可能對動(dòng)脈粥樣硬化起到一定的預(yù)防作用。

綜上所述，本研究通過比較分析自體來源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞回輸前后獼猴的血液生化指標(biāo)，提示該細(xì)胞具有一定的延緩衰老或改善老年性功能退變的作用。這僅是初步的觀察結(jié)果，詳細(xì)作用及機(jī)制還需要深入研究。

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Induction of body cell retrodifferentiation intomultipotential stem cell in vitro and its effects on senilemonkey

Zhu Xiangqing,Cai Xuemin,Wang Qiang,Shen Lirong,Zhu Guangxu,Pang Rongqing,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/The Nation and Region Integrated Engineering Laboratory of Stem Cell and Immunocyte Biological Technology/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To discuss the method for the induction of peripheral blood mononuclear cell retrodifferentiation into multipotential stem cell in vitro and the effects of inducer cell on senile rhesus monkeys'senescence-related blood biochemical indicators.Methods Themonkeys'peripheral bloodmononuclear cellswere induced to transform intomultipotential stem cells by the co-culturewith fish oocyte extract in vitro.Those cellswere intravenously re-infused to senile rhesusmonkeyswith the age of 20 to 24 years old.The weight,blood routine,and superoxide dismutase(SOD)were detected and compared before and after the reinfusion. Results Threemonths after the reinfusion,compared with themonkeys receiving the reinfusion of self-induced multipotential stem cells,those taking the reinfusion ofmultipotential stem cells induced in vitro had no significant changes in weight,but their vigor of SOD and platelet number in peripheral blood significantly increased.The content of blood Na+,K+,CO2,and AG significantly increased.However,the content of creatinine,uric acid,and LDL-cholesterol significantly decreased.Conclusion Fish oocyte extract can induce the retrodifferentiation of partial peripheral blood mononuclear cells intomultipotential stem cells which can significantly improve senescence-related blood biochemical indicators.

rhesusmonkey;inducedmultipotential stem cell;biochemical indicator;adult cell;anti-aging

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0816-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.002

2015-04-17）

國家科技支撐計(jì)劃（2014BI01B0）；云南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)專項(xiàng)（2013DA004）

650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心,干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室

龐榮清,E-mail：pangrq2000@aliyun.com；潘興華,E-mail：xinghuapang@aliyun.com