詹 欣 張玲云 王志華

茶多酚對卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬水平的影響及相關(guān)機(jī)制研究

詹 欣 張玲云 王志華

目的研究茶多酚（EGCG）對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬水平的影響及相關(guān)機(jī)制。方法用EGCG處理SKOV3細(xì)胞，Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-II及蛋白激酶B（PKB）信號通路相應(yīng)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果EGCG處理SKOV3細(xì)胞后，自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)上調(diào)，并呈一定的時間濃度依賴性。EGCG處理SKOV3細(xì)胞后，AKT的磷酸化水平下調(diào)，AKT激活劑胰島素樣生長因子1（IGF-1）預(yù)處理后，自噬相關(guān)蛋白LC3-II高表達(dá)被抑制。結(jié)論EGCG通過AKT介導(dǎo)的信號通路誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞自噬水平升高。

卵巢癌；SKOV3細(xì)胞；茶多酚；PKB；自噬

茶多酚是從茶葉中提取的主要活性成分之一，目前研究表明其具有多種藥理作用[1]。自噬（autophagy）是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下通過降解損傷細(xì)胞器或代謝產(chǎn)物促進(jìn)細(xì)胞存活的防御機(jī)制[2]，自噬水平升高時，胞漿型微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3），即 LC3-I，會轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3，即LC3-II，故本研究以自噬相關(guān)蛋白LC3-II作為評估自噬水平高低的標(biāo)準(zhǔn)。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療過程中起著非常重要的作用[3]。研究[4]表明，茶多酚能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡率增加。本研究觀察茶多酚對卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬水平的影響及其相關(guān)信號通路，為臨床卵巢癌治療提供新的思路及靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞研究所；抗LC3-B多克隆抗體購自Novus公司；蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）多克隆抗體、磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B，p-AKT）多克隆抗體均購自Cell Signaling公司；抗GAPDH單克隆抗體購自Santa Cruz公司；IMDM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國HyClone公司；胰島素樣生長因子（IGF-1）購自R&D公司；胎牛血清購自四季青公司；3-MA購于Sigma公司。

1.2方 法

1.2.1 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。0.25%胰酶（含EDTA）消化傳代。培養(yǎng)24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。

1.2.2 Western blot檢測蛋白量變化 Western blot檢測蛋白LC3、p-AKT、AKT的變化。收集SKOV3細(xì)胞后，用RIPA裂解液冰上裂解30min，13 000g離心10min，吸取上清，BCA法蛋白定量。與5×樣品緩沖液混合后，煮沸 6min。取樣品（40μg）進(jìn)行 SDS-聚丙烯凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1h，相應(yīng)的一抗4℃孵育過夜，TBS-T洗10min×3次，加入含辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，ECL法顯色曝光，圖像采用LAS-4000-mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EGCG誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞自噬 用不同濃度（0、10、20μg/mL）EGCG 處理 SKOV3 細(xì)胞 2h，0μg/mL 組作為對照組，可以觀察到自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)量增加，并呈一定濃度依賴性（n=3，P＜0.05，見圖1A）。在不同時點(diǎn)（0、1、2、6h）20μg/mL EGCG 處理SKOV3細(xì)胞，以0h為對照組，隨著時間變化，自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)量先升高后下降，峰值出現(xiàn)在1～2h（n=3，P＜0.05，見圖 1B）。以上結(jié)果表明 EGCG能誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞自噬水平升高，并呈一定的濃度和時間依賴性。

圖1A EGCG誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)量與濃度的關(guān)系

圖1B EGCG誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)量與時間的關(guān)系

2.2 AKT信號通路在EGCG誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞自噬過程中的作用 EGCG刺激SKOV3細(xì)胞之后，p-AKT和的表達(dá)水平隨著作用時間的延長而下降，并在30或 60min時達(dá)最低值（n=3，P＜0.05，見圖 2A，以0min為對照組）。表明在SKOV3細(xì)胞中，EGCG可以抑制AKT信號通路。為進(jìn)一步明確AKT信號通路在EGCG誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的作用，用AKT激活劑 IGF-1（insulin-like growth factor 1，200ng/mL）激活A(yù)KT信號通路，以未處理為對照組，IGF-1對SKOV3細(xì)胞LC3-Ⅱ的表達(dá)無影響（n=3，P＞0.05，見圖2B），EGCG處理組LC3-II的表達(dá)明顯增加（n=3，P＜0.05，見圖2B），IGF-1提前2h預(yù)處理組能顯著抑制EGCG誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)（n=3，P＜0.05，見圖 2B），表明 AKT 信號通路在 EGCG 誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞自噬的過程中起著重要作用。

圖2A EGCG抑制AKT信號通路與時間的關(guān)系

圖2B AKT信號通路在EGCG誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞自噬中的作用

3 討 論

茶多酚是從茶葉中提取的重要活性成分之一，研究[5]表明，其具有抗腫瘤作用，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖和遷移。付春紅等[4]研究表明，茶多酚對SKOV3細(xì)胞的生長有明顯抑制作用并能夠誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡，推測活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的增高可能是導(dǎo)致卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的原因。

自噬是廣泛存在的一種生命現(xiàn)象，細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下形成自噬體膜，包裹損傷細(xì)胞器或代謝產(chǎn)物，并與溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體，最后降解包裹內(nèi)容物，以維持細(xì)胞本身代謝需要及細(xì)胞器的更新，對細(xì)胞在不利環(huán)境下的存活有重要意義[6]。有多條信號通路參與了對自噬的調(diào)節(jié)，各條信號通路之間又相互交聯(lián)，極其復(fù)雜[7]。目前研究較多的為mTOR（mammalian target of rapamycin）信號通路[8]。一般情況下mTOR處于活化狀態(tài)，磷酸化抑制自噬的發(fā)生。但是在細(xì)胞氧化應(yīng)激、缺血缺氧、炎癥刺激等應(yīng)激狀態(tài)下，AMP/ATP（一磷酸腺苷/三磷酸腺苷）比值增加，增強(qiáng) AMPK（Adenosine 5‘-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMP依賴的蛋白激酶）活性，從而抑制mTOR的磷酸化水平，促進(jìn)細(xì)胞自噬。

自噬與凋亡之間關(guān)系密切，其上游多條信號通路基本相同[9]。多種抗腫瘤藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的自噬，但自噬在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用一直存在爭議，部分學(xué)者認(rèn)為過度的自噬導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生了自噬性死亡，并稱為II型程序性細(xì)胞死亡[10]，但部分學(xué)者認(rèn)為自噬僅為腫瘤細(xì)胞凋亡過程中的伴隨現(xiàn)象，而非自噬介導(dǎo)的死亡[11]。Satoh等[12]報(bào)道茶多酚能夠誘導(dǎo)人間皮瘤細(xì)胞凋亡及自噬水平均升高，但抑制自噬能明顯增加茶多酚誘導(dǎo)的人間皮瘤細(xì)胞凋亡率，說明自噬在茶多酚誘導(dǎo)間皮瘤細(xì)胞凋亡過程中起應(yīng)激性保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，茶多酚能夠誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬水平升高，并呈一定的時間濃度依賴性，隨著茶多酚濃度增加，SKOV3細(xì)胞自噬水平逐漸升高，以一定濃度EGCG刺激SKOV3細(xì)胞，其自噬水平先升高，后下降，在1～2h達(dá)到頂峰。EGCG刺激之后，p-PKB的表達(dá)水平隨著作用時間的延長而下降，說明EGCG抑制了PKB信號通路的表達(dá)，但使用PKB激活劑IGF-1激活PKB信號通路后，明顯抑制了EGCG誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞自噬水平，這表明PKB信號通路在EGCG誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞自噬的過程中起著重要作用。但EGCG誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞自噬在EGCG誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞凋亡中所起的作用尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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（收稿：2014-04-12 修回：2014-08-04）

Effect of EGCG-induced Autophagy on Human Ovarian Cancer Cell Line SKOV3 and the UnderlyingMechanism

ZHAN Xin,ZHANG Lingyun,WANG Zhihua.Department of Obstetrics&Gynecology,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of EGCG-induced autophagy on human ovarian cancer cell line SKOV3 and to explore the mechanism.MethodsHuman ovarian cancer cell SKOV3 were treated with EGCG,then autophage-associated protein LC3-II and AKT protein expression on the cells was detected by Western blot.ResultsAfter EGCG treatment,the level of LC3-II was up-regulated in a dose dependent manner,while the level of phospho-AKT was decreased.Pretreatment with AKT activator insulin-like growth factor 1,the EGCG-induced LC3-II expression was suppressed.ConclusionEGCG can induce autophagy in huaman ovarian cancer cell SKOV3 through AKT signaling pathway.

ovarian cancer；SKOV3 cells；epigallocatechin-3-gallate；PKB；autophagy

杭州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（杭州 310006）

王志華，Tel：15868189500