王芬　韓鵬

摘 要：為研究紅提葡萄霜霉病拮抗菌SZ9、LT3無菌發(fā)酵濾液的穩(wěn)定性，以紅提葡萄霜霉病病原菌為指示菌，采用牛津杯法測定無菌發(fā)酵濾液的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、儲藏穩(wěn)定性以及光穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，兩株菌的抑菌活性物質(zhì)在pH 值5～9、-10～50 ℃時均表現(xiàn)出很強的抑菌活性，具有較好的耐儲性，紫外燈照射10 h后仍具有較高的活性。研究認為拮抗菌SZ9、LT3無菌發(fā)酵濾液具有較強的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、耐儲藏和光穩(wěn)定性，具有一定的開發(fā)和應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：紅提葡萄霜霉??；拮抗菌；生物防治；穩(wěn)定性

中圖分類號：S436.631 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.08.027

紅提葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌[Plasmopara viticola（Berk.et Curtis） Berl.etde Toni]引起的真菌病害[1]。該病害遍及全國各大紅提葡萄種植產(chǎn)區(qū)，是紅提葡萄生產(chǎn)的一大病害，尤其是春、夏多雨年份更為嚴重。霜霉病主要危害紅提葡萄的葉片，同時還能危害新梢、幼果和花序等部分及成熟果實，染病的植株長勢極弱，果實質(zhì)量差，影響當年紅提葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，增加生產(chǎn)成本，嚴重的還會造成植株不能正常越冬，影響樹勢和來年生產(chǎn)，甚至整株死亡[2-5]。

目前該病的防治主要通過化學方式防治，但其往往會帶來農(nóng)藥殘留過高、嚴重破壞葡萄的生態(tài)環(huán)境等問題[6-7]。生物防治技術(shù)是近年來發(fā)展的一種安全、無污染、無殘留的病害防治方法，不容易產(chǎn)生抗藥性，低殘留，具有對人畜無毒害、對生態(tài)環(huán)境影響小等多種優(yōu)點，因此引起越來越多的人對其進行開發(fā)研究，期望其能作為病害防治的重要途徑[8]。

SZ9、LT3菌株是筆者所在實驗室從紅提葡萄大田根際的土壤中篩選出的對紅提葡萄霜霉病、白粉病、炭疽病均有較強抑菌效果的拮抗菌株，本研究提取SZ9、LT3菌株的發(fā)酵濾液，以霜霉病為指示菌，對這兩株菌種的拮抗效果的穩(wěn)定性進行初步探討，以期對該病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

病原菌：紅提葡萄霜霉病病原菌Plasmopara viticola從陜西省微生物研究所獲得，病原菌接種于PDA斜面上，冰箱3 ℃保存。

拮抗菌：前期試驗篩選取得，實驗室NA斜面培養(yǎng)基保存。

培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，加入1.5%～2%的瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液的制備 用接種針挑取NA固體斜面上保存的SZ9、LT3菌種，在NA固體平板上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取單菌落于NA液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，225 r·min-1搖床培養(yǎng)36 h。將發(fā)酵液8 000 r·min-1離心15 min，取其上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，得發(fā)酵濾液。

1.2.2 拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液拮抗穩(wěn)定性測定

（1）拮抗菌株發(fā)酵濾液抑菌圈測定。以紅提葡萄霜霉病病原菌為指示菌，利用牛津杯法測定發(fā)酵濾液的抑菌活性[9]。首先將病原菌液涂布于NA固體平板上，把滅過菌的牛津杯放置于平板中央，吸取1 mL的拮抗菌發(fā)酵濾液于牛津杯中，把平板放置在超凈臺中，直至液體完全滲透，每次試驗重復3次。30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，觀察結(jié)果并測定抑菌圈大小[10]。

（2）熱穩(wěn)定性測定。分別取SZ9、LT3菌株的發(fā)酵濾液于三角瓶中，每個三角瓶20 mL，分別在-10，0，30，50，70，90，121 ℃中處理15 min，牛津杯法測定各處理發(fā)酵液對紅提葡萄霜霉病病原菌的抑菌效果。

（3）酸堿穩(wěn)定性測定。分別取SZ9、LT3菌株的發(fā)酵濾液于三角瓶中，每個三角瓶20 mL，用1 mol·L-1 HCl和NaOH將發(fā)酵濾液的pH值調(diào)至3～11，靜置2 h，牛津杯法測定各處理發(fā)酵濾液對紅提葡萄霜霉病病原菌的抑菌效果。

（4）儲存時間穩(wěn)定性測定。 取SZ9、LT3菌株的發(fā)酵濾液于三角瓶中，每個三角瓶20 mL，分別放置在冰箱（4 ℃）中，以未放置處理的發(fā)酵濾液為對照，每2個月進行1次試驗，牛津杯法測定各處理對紅提葡萄霜霉病病原菌的抑菌效果。

（5）紫外線照射穩(wěn)定性測定。取SZ9、LT3菌株的發(fā)酵濾液于三角瓶中，每個三角瓶20 mL，置于25 W的紫外線燈下，距燈5 cm處分別照射2，4，6，8，10 h，以未經(jīng)紫外線照射處理的發(fā)酵濾液作對照，牛津杯法測定各處理對紅提葡萄霜霉病的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌無菌發(fā)酵液熱穩(wěn)定性

如圖1所示，隨著處理溫度的變化，兩株拮抗菌SZ9、LT3的抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力均有變化，在-10，0，30，50 ℃ 4種溫度處理下，兩株菌種都保持較高的抑菌活性，其中30 ℃的處理下，抑菌活性最高。SZ9在70 ℃的處理下，活性顯著下降，LT3在70 ℃的處理下活性有所下降，兩株拮抗菌在90 ℃和121 ℃的處理下均基本失活。

2.2 拮抗菌無菌發(fā)酵液對酸堿的穩(wěn)定性

如圖2所示，隨著pH值的變化，兩株拮抗菌SZ9、LT3的抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力均有所變化，pH值為5～9的范圍內(nèi)，抑菌活性較為穩(wěn)定，當pH值小于5.0或者大于9.0時，抑菌活性下降十分顯著，說明這兩株拮抗菌的活性物質(zhì)對極端的酸堿條件比較敏感。

2.3 拮抗菌無菌發(fā)酵液儲存時間的穩(wěn)定性

如圖3所示，隨著放置時間的增加，拮抗菌SZ9、LT3的抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力表現(xiàn)比較穩(wěn)定，說明放置時間對無菌發(fā)酵濾液的抑菌效果影響不大。

2.4 拮抗菌無菌發(fā)酵液對紫外線的穩(wěn)定性

如圖4所示，拮抗菌SZ9、LT3無菌發(fā)酵液在紫外光下照射2～10 h后，其抑菌活性沒有顯著的降低，表明兩株拮抗菌在紫外線的照射下仍能保持較強的抑菌活性。

3 結(jié)論與討論

拮抗菌防治病害是克服化學防治方法帶來的生態(tài)環(huán)境破壞、毒害殘留等負影響的重要手段，篩選和研發(fā)生物拮抗對于安全有效防治紅提葡萄真菌病害具有重要意義[11-12]。但生物拮抗制劑在實際生產(chǎn)和加工的過程中，由于自身理化穩(wěn)定性的影響，其抑菌物質(zhì)可能會受到破壞而失活，篩選出來的拮抗菌也就不能很好地應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中，因此，拮抗菌株的穩(wěn)定性研究也十分重要[13-14]。

拮抗菌株SZ9、LT3是前期試驗所篩選出來的對紅提葡萄常見的真菌病害均具有較好抑菌效果的菌。本研究對其抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進行了進一步的研究，結(jié)果表明，兩株拮抗菌均具有較強的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、儲藏穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，具有進一步研發(fā)成生物制劑的潛力。

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