楊麗麗+王曉娥+李占東

摘 要：高分子熒光微球是一種性能良好的蛋白質載體，因可連接多種生物活性物質而便于多參數(shù)分析等，在生物醫(yī)學領域被廣泛使用。本研究將聚苯乙烯微球作為蛋白質載體，建立一種新的檢測禽流感病毒的血清學方法。結果表明，微球與單克隆抗體、抗原、多克隆抗體和熒光二抗形成了雙夾心的微球復合物，建立了禽流感病毒定量免疫診斷的基礎。

關鍵詞：禽流感病毒；熒光微球；檢測

中圖分類號：S852.64 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.

禽流感（Avian influenza，AI）是由甲型流感病毒引起的一種人畜共患的傳染性疾病綜合征。根據致病性的不同，禽流感可分為高致病性、低致病性和非致病性三級，是危害養(yǎng)殖業(yè)的最重要的疾病之一[1]。高致病性禽流感（High pathogenic avian influenza，HPAI）被世界動物衛(wèi)生組織列為動物傳染病中的A類疫病[2]，在世界范圍內具有重要的防疫性和檢疫性。禽流感病毒的實驗室診斷方法主要有病毒的分離與鑒定、血清學診斷技術[3-5]、分子生物學診斷技術[6-9]、電鏡技術等。新近發(fā)展起來的熒光微球因其材料不同而種類很多，由早期的聚苯乙烯微球，到后來出現(xiàn)的多種材料的高分子微球，如聚丙烯酸脂、二氧化硅、聚多糖類、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡啶等類型，其中聚苯乙烯微球目前仍被廣泛應用[10-11]。以微球為載體，建立了基于熒光微球的流式細胞術檢測方法。熒光微球穩(wěn)定性好、粒度均一、單分散性好，其球形表面的弧度使抗體結合位點的暴露面與抗原決定簇處于最佳的反應狀態(tài)，既使發(fā)光效率穩(wěn)定高效又提高了反應的靈敏度，因而在生物醫(yī)學、食品安全、分析化學以及某些高新技術領域都有著很重要的應用[12-13]。本研究是在高分子熒光微球、免疫熒光技術與流式細胞術等試驗原理基礎上建立的一種新型免疫學試驗方法。

1 材料和方法

1.1 試 劑

紅色熒光微球：（Spherotech，Inc）直徑為4.0 μm，108個·mL-1；EDC[1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）-碳二亞胺]：購自美國SIGMA公司；NHS（N-羥基琥珀酸亞胺）：購自美國SIGMA公司；禽流感H5亞型單克隆抗體購自揚州大學；禽流感H5亞型基因工程表達抗原購自揚州大學；禽流感病毒多克隆抗體由本研究組自行研制；FITC標記的羊抗小鼠熒光抗體：購自SIGMA公司；FITC標記的羊抗兔熒光抗體：購自SIGMA公司；0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（PBS）：pH=7.4；家兔：購自白求恩醫(yī)大試驗動物中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 兔抗禽流感抗體的制備及純化 多克隆抗體制備的免疫方法采用背部多點注射法。選取兩只成年公兔，注射禽流感H5亞型滅活疫苗每只1 mL。免疫3次后，測定抗體的效價。當抗體效價達到210以上時，心臟采血分離血清。將血清純化、濃縮后測定蛋白含量至1 mg·mL-1以上，分裝后置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 ELISA法確定抗體與抗原的匹配性 應用PBS緩沖液將單克隆抗體稀釋成10，5.0，2.5，1.0 μg·mL-1后，于96孔ELISA酶標板縱行包被，放置在4 ℃冰箱過夜，洗滌后加入1%的封閉液BSA，恒溫37 ℃封閉1 h，洗滌3次后加入1∶10稀釋的禽流感H5亞型表達抗原，放置37 ℃1 h，取出后洗滌。酶標板中加入5 μg·mL-1的兔抗禽流感抗體，放置37 ℃ 1 h，洗滌后加入稀釋的酶標羊抗兔IgG二抗，放置37 ℃1 h，洗滌后加入臨時配制的底物溶液，顯色反應15 min，于反應孔中加入2 mol·L-1硫酸終止反應。450 nm波長下測定OD值。陰性對照同時進行。以此確定單克隆抗體和多克隆抗體與抗原是否匹配。

1.2.3 單克隆抗體的固定 取1 μL直徑為4.0 μm羧基熒光微球原液，加入EDC和NHS溶液活化30 min，用pH值7.4的PBS緩沖溶液離心洗滌已活化的微球，加入100 μL禽流感H5亞型單克隆抗體與微球連接，放置搖床于室溫振蕩2 h。充分離心洗滌后加入含有1%BSA的100 μL PBS溶液，室溫振蕩2 h后放置在4 ℃冰箱過夜，以此阻斷微球表面的未反應位點。

1.2.4 微球雙夾心法的流式測定 將連接了單克隆抗體的微球離心洗滌后置于100 μL的PBS溶液中。將一定量的禽流感陽性抗原加入，放置于室溫振蕩2 h。離心洗滌微球以去除未反應的陽性抗原。再加入一定量的禽流感多克隆抗體，放置于室溫振蕩2 h。將微球充分離心洗滌使未反應的抗體去除。最后加入一定量的FITC標記的羊抗兔熒光抗體，置搖床室溫振蕩2 h。離心洗滌3次，去除未反應的羊抗兔熒光抗體。重新將微球放于100 μL的PBS溶液中，然后用流式細胞儀分析測定獲得標準曲線。

2 結果與分析

2.1 雙夾心ELISA篩選結果

應用雙夾心ELISA試驗來檢測單克隆抗體和多克隆抗體是否匹配的結果見表1。重復3次，設陰性對照。不同濃度的單克隆抗體所測得的OD值在1.5左右，陰性抗原的OD值平均為0.15，以P/N=2.1為臨界點，即0.16×2.1=0.315為臨界點，測定的OD值大于0.315時即為陽性，如表1結果所示，測定的OD值均為陽性，說明單克隆抗體、抗原、多克隆抗體三者相匹配。

2.2 單克隆抗體連接量的確定

將禽流感單克隆抗體用PBS溶液稀釋成不同的濃度后與活化微球連接，洗滌3次后加入FITC標記的羊抗小鼠熒光抗體與之反應，通過流式細胞儀檢測的熒光信號強度確定單克隆抗體的最佳工作濃度。當FITC綠色熒光信號與微球的紅色熒光信號被同時檢測出，即達到了“雙陽性”時，說明微球與抗體已連接。已連接抗體的微球與微球總數(shù)的比值用連接率表示。結果如表2所示，當單克隆抗體連接濃度為300 μg·mL-1時，平均連接率達到 87.6%，因此確定300 μg·mL-1為單克隆抗體的最佳反應濃度。

2.3 多克隆抗體最佳反應濃度的確定

將活化的熒光微球與最佳濃度單克隆抗體連接后加入1%的BSA進行封閉，然后加入過量的抗原與其連接，最后加入不同濃度的多克隆抗體及一定量的FITC標記的羊抗兔熒光抗體。應用流式細胞儀檢測反應體系，當微球的紅色熒光信號與熒光抗體的FITC綠色熒光信號被同時檢測到，即達到了“雙陽性”時就可確定多克隆抗體最佳濃度及與微球的連接率。試驗結果表明，當多克隆抗體的濃度為150 μg·mL-1時，平均連接率達到 87.5%，如圖1所示。

3 結論與討論

3.1 單克隆抗體與熒光微球的連接

微球表面連接的單克隆抗體數(shù)量的多少與最終檢測信號強度的高低有直接關系。但是當單克隆抗體在微球表面飽和時，連接率不會隨著單克隆抗體濃度的增加而有所提高。同時應用未活化的微球與一定量的熒光抗體進行反應，檢測熒光抗體與熒光微球的非特異性結合能力，試驗結果表明未活化微球與熒光抗體之間無非特異性結合。由此看來，此方法可以避免非特異性反應，優(yōu)于傳統(tǒng)的ELISA 方法。

3.2 連接方式比ELISA方法更穩(wěn)定

微球與單克隆抗體的連接不同于傳統(tǒng)的ELISA方法，ELISA方法是通過單克隆抗體與聚苯乙烯本物理結合（非特異性吸附），疏水連接的。而基于微球的流式細胞檢測方法是通過共價鍵與微球結合的，非常穩(wěn)定。

3.3 數(shù)據的讀取與重復性

在傳統(tǒng)ELISA方法的重復過程中有很大的變化，并且不同孔之間也有很大的變化。它是一種間接和動態(tài)的方式，在酶的擴大效應下以顏色的變化量來讀取數(shù)據，在擴大效應中容易出現(xiàn)錯誤。流式細胞術分析方法的特點是它與傳統(tǒng)的ELISA方法相比更加準確和敏感。用流式細胞儀檢測時，使單個微球逐個通過激光器，讀取的是熒光數(shù)據，數(shù)據結果更加直接、敏感、穩(wěn)定。

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