曾云勝 張玲莉

[摘要] 目的 比較顯色基質(zhì)法與凝膠法檢測乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細菌內(nèi)毒素的效果。 方法 采用樣品稀釋法研究顯色基質(zhì)鱟試劑對不同批號乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的干擾，并與凝膠法鱟試劑對樣品的干擾試驗比較。 結(jié)果 顯色基質(zhì)法標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)≥ 0.98，乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液在0.5 mg/mL濃度時無干擾作用，明顯高于凝膠法無干擾濃度（0.125 mg/mL）。 結(jié)論 與凝膠法比較，顯色基質(zhì)法有靈敏、快速、能定量、重復性好的特點，可用于乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液內(nèi)毒素含量的測定。

[關(guān)鍵詞] 顯色基質(zhì)鱟試劑法；凝膠法；細菌內(nèi)毒素；干擾試驗；乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（c）-0092-04

注射用乳酸環(huán)丙沙星具有廣譜抗菌作用，是較早應(yīng)用于臨床的喹諾酮類藥物，尤其對需氧革蘭陰性桿菌引起的感染有效，由于其價格低廉，療效明確，因此在臨床上被廣泛應(yīng)用。2010年版《中國藥典》規(guī)定乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液熱原檢測采用家兔法[1]，國家藥典委員會于2012年8月3日已經(jīng)公布的《關(guān)于注射用乳酸環(huán)丙沙星的國家標準草案的公示》，其中規(guī)定了“細菌內(nèi)毒素檢查”，用0.06 EU/mL或更高靈敏度的鱟試劑凝膠法檢查（《中國藥典》2010版二部附錄ⅪE[1]），每毫克環(huán)丙沙星中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.50 EU。在凝膠法檢查基礎(chǔ)上，筆者依顯色基質(zhì)法規(guī)定，通過試驗進行乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液中顯色基質(zhì)法檢查的方法學研究，以期為環(huán)丙沙星檢測內(nèi)毒素尋求較為合適的方法。

細菌內(nèi)毒素檢查法是檢測供試品中細菌內(nèi)毒素的限量的方法，主要方法分為凝膠法和光度測定法，后者包含濁度法和顯色基質(zhì)法。法定標準規(guī)定越來越多的注射制劑采用此法控制藥品中熱原的含量。近年來，藥典委員會要求各地藥檢部門做了很多工作，研究細菌內(nèi)毒素檢測方法的合理性和可靠性。筆者對乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細菌內(nèi)毒素檢測進行方法學研究，建立了顯色基質(zhì)法檢測該藥中細菌內(nèi)毒素方法，相比凝膠法，更快速準確。

1 儀器與試劑

1.1 顯色基質(zhì)鱟試劑盒

顯色基質(zhì)鱟試劑（批號：120603）1.7 mL，顯色基質(zhì)（批號：120605）1.7 mL，偶氮化試劑一（批號：120628）10 mL，偶氮化試劑二（批號：120629）10 mL，偶氮化試劑三（批號：120630）10 mL，HCl反應(yīng)終止劑（批號：120623）50 mL。由廈門市鱟試劑試驗廠有限公司生產(chǎn)。

1.2 凝膠法鱟試劑

鱟試劑（靈敏度0.25 EU/mL，廈門市鱟試劑試驗廠有限公司，批號：130917）；鱟試劑（靈敏度0.03 EU/mL，廈門市鱟試劑試驗廠有限公司，批號：030511）；鱟試劑（靈敏度0.03 EU/mL，湛江安度斯生物有限公司，批號：1301161）。

1.3 其他試劑

細菌內(nèi)毒素標準品（CSE）（100 EU/支，中國藥品生物制品檢定所，批號：150608-201298）；細菌內(nèi)毒素檢測用水（BET水）（廈門市鱟試劑試驗廠有限公司，批號：130428）50 mL。

1.4 樣品

乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液（商品名：西普樂，拜耳制藥有限公司，100 mL∶0.2 g∶0.9 g）3批（批號：BXGG4D7、BXGG4F1、BXGG4C6）。

1.5 其他材料

紫外可見分光光度計UV-2450（日本島津儀器公司），除熱原吸頭（200、1000 μL），玻璃比色杯（0.5 cm），渦旋混合儀Vortex-Genie 2（美國Scientific Industries），電熱恒溫水浴鍋TZL-5003（蘇州珀西瓦爾試驗設(shè)備有限公司），定量可調(diào)移液器（上海求精玻璃儀器廠，100～1000 μL，20～200 μL）盛冰水托盤，試管架。

2 方法與結(jié)果

2.1 確定供試品內(nèi)毒素限值

細菌內(nèi)毒素限值L=K/M，其中K表示人每千克體質(zhì)量每小時最大可接受的細菌內(nèi)毒素劑量，藥典規(guī)定一般注射劑為5 EU/（kg·h），M表示人每千克體質(zhì)量每小時的最大供試品劑量[1]。乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液說明書規(guī)定成人1 h靜注最大劑量600 mg，人均體質(zhì)量按60 kg估算，則M=10 mg/（kg·h）。計算得出本品的細菌內(nèi)毒素限值L=0.5 EU/mg，環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的濃度為2 mg/mL，限值即為L=1 EU/mL。

2.2 可靠性試驗

顯色基質(zhì)法標準曲線的繪制：取細菌內(nèi)毒素標準品（CSE）1支，加入1 mL BET水復溶，旋渦震蕩混合15 min，即得100 EU/mL細菌內(nèi)毒素溶液，然后取0.1 mL細菌內(nèi)毒素溶液，加入BET水0.9 mL，渦旋震蕩30 s，稀釋為10 EU/mL，再繼續(xù)用BET水將其稀釋至1 EU/mL細菌內(nèi)毒素母液，備用。取相應(yīng)量鱟試劑、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑二、偶氮化試劑三分別用BET水溶解，偶氮化試劑一用HCl反應(yīng)終止劑溶解，震蕩10 s，備用。取2 mL空安瓿15支，分別加入細菌內(nèi)毒素檢查用水（1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mL）和1 EU/mL的細菌內(nèi)毒素母液（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL）制成系列細菌內(nèi)毒素標準溶液（分別含有細菌內(nèi)毒素0、0.2、0.4、0.6、0.8 EU/mL）。取標準溶液0.1 mL分別加入反應(yīng)試管中（冰浴，預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑的除熱原玻璃試管10 mm×75 mm），震蕩10 s后，置于37℃水浴箱中孵育10 min，取出試管；加入顯色基質(zhì)0.1 mL（冰?。僦萌?7℃水浴箱孵育6 min，取出試管；迅速加入偶氮試劑一（冰浴）、偶氮試劑二、偶氮試劑三各0.5 mL。靜置5 min后，檢測樣品反應(yīng)液在545 nm處的吸光度，用空白對照管校正。平均吸光度測定值依次為0.03、0.153、0.311、0.456、0.641。平均吸光度對內(nèi)毒素濃度作線性回歸，得標準曲線Y=0.7256X+0.1878（r=0.9972），r ≥ 0.98，試驗有效。