程娟，鹿保鑫，王霞，易偉民

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319）

脂肪酶是一類特殊的酯鍵水解酶[1]，能催化油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。此外，還可以用于生物表面活性劑的合成、多肽合成、聚合物的合成和藥物的合成等[2]。而固定化脂肪酶是將脂肪酶通過物理或化學的方法制備成為不溶于水的，但仍具有催化活性的復合體，這一過程是將單體的游離脂肪酶轉(zhuǎn)變成了復合脂肪酶催化劑[3-4]。將脂肪酶進行固定化，可以提高酶的專一性以及穩(wěn)定性等，使酶的性質(zhì)更加穩(wěn)定，且反應條件溫和，副產(chǎn)物少，易于分離[5]。目前固定化脂肪酶的制備上還存在一些限制因素[6-7]，例如，在固定化上載體的設計上、在制備和選用上，固定化脂肪酶的方法等方面[8]。

在特異性上脂肪酶的區(qū)分不是很明顯，根據(jù)反應條件的不同，其特異性也有差異[9]，所以，試驗以兩種不同的脂肪酶為原料，分別進行固定化，考察了硅烷化試劑添加量、硅藻土與酶的質(zhì)量比、溫度、時間等四個因素對酶的固定化的影響，并對影響因素進行了單因素試驗，確定了最佳的工藝參數(shù)，希望為實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術上的支持。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

脂肪酶（Lipase）：Sigma 公司生產(chǎn)；乙烯基三甲氧基硅烷，南京化學試劑有限公司；鹽酸，南京化學試劑有限公司；過氧化氫，南京化學試劑有限公司；甲苯，南京化學試劑有限公司；乙醇，南京化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

DK-S24 電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；AR2140 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；RE52-98 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHY-2 恒溫水域振蕩器，江蘇金壇環(huán)宇科學儀器廠；JJ-1 精密定時電動攪拌器，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；LD4-40 低速大容量離心機，北京京立離心機有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羥基化處理

準確稱取20 g 硅藻土顆粒，將其放在容量為250 mL 的圓底燒瓶中，分別向其中加入1 mol·L-1的HCl 35 mL，再加入質(zhì)量分數(shù)為25%的H2O2溶液35 mL，最后加入175 mL 的去離子水，充分混勻，然后用攪拌槳在80 ℃水浴鍋條件下攪拌5 min 后，停止攪拌靜置分層，將上層混合液倒掉，反復用去離子水洗滌至少5 次，取出硅藻土，放置在平皿上，放置在70 ℃的恒溫干燥箱中干燥。

1.3.2 硅烷化處理

稱取10 g 經(jīng)過羥基化處理后的硅藻土放置在容量為100 mL 的圓底燒瓶中，依次向其中加入少量硅烷化試劑和40 mL 甲苯充分混勻，用攪拌槳于室溫條件下攪拌1 h，待反應結(jié)束后，靜置分層，倒掉上層混合液，用甲苯和乙醇的混合液充分洗滌硅藻土3次以上，取出硅藻土，放置在平皿中室溫干燥即可得到經(jīng)硅烷化處理后的硅藻土。

1.3.3 脂肪酶的固定和活力測定

在4 mL pH 7.0，0.03 mol·L-1的tris-HCl 緩沖溶液中加入0.02 g 脂肪酶，分裝在離心管中，離心條件為8 000 r·min-1離心10 min，用移液槍分別稱取上清液于50 mL 燒杯中，將一定質(zhì)量的經(jīng)過處理后硅藻土載體加入到酶液中，將瓶口密封，將其放在一定溫度的搖床中緩慢震蕩一定時間后取出，過濾燒杯中的混合物，用同樣的緩沖液沖洗固體數(shù)次，最后將其取出，放置在平皿上，干燥。這時所得的即為吸附固定化酶。而酶的活力測定參照國標GB/T5523-2008測定。

1.3.4 硅烷化試劑添加量對固定脂肪酶活力的影響

硅烷化添加量分別調(diào)為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%，硅藻土與酶的質(zhì)量比為4∶1，固定溫度為30 ℃，固定時間為6 h。在此條件下，檢驗硅烷化試劑對固定化脂肪酶活力的影響。

1.3.5 硅藻土與酶質(zhì)量比對固定脂肪酶活力的影響

硅藻土與酶的質(zhì)量比分別調(diào)為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 和6∶1，硅烷化試劑添加量為0.3%，固定溫度為30 ℃，固定時間為6 h。在此條件下，檢驗硅藻土與酶質(zhì)量比對固定脂肪酶活力的影響。

1.3.6 固定溫度對固定脂肪酶活力的影響

溫度分別設置為22、24、26、28、30、32 ℃，硅藻土與酶的質(zhì)量比為4∶1，硅烷化試劑添加量為0.3%，固定時間為6 h。在此條件下，檢驗固定溫度對固定化脂肪酶活力的影響。

1.3.7 固定時間對固定脂肪酶活力的影響

固定時間分別設置為3、4、5、6、7 、8 h，硅烷化試劑添加量為0.3%，硅藻土與酶的質(zhì)量比為4∶1，固定溫度為30 ℃。在此條件下，檢驗固定時間對固定脂肪酶活力的影響。

1.3.8 響應面法優(yōu)化固定酶的最佳條件

通過單因素試驗確定各因素的范圍，以固定脂肪酶酶活性為響應值進行四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計，并采用Design-Expert.V8.0.6 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到最佳的固定化條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 硅烷化試劑添加量對固定脂肪酶活力的影響

由圖1 可知固定脂肪酶活力隨著硅烷化試劑添加量先升高后降低，在硅烷化試劑添加量為0.4%達到最大值，硅烷化試劑添加量過高導致固定脂肪酶活力降低是因為偶聯(lián)劑過多使游離的化學鍵過多，起不到固定作用。

圖1 硅烷化試劑添加量對固定脂肪酶活力的影響Fig.1 Impacts of additive amount of silicon alkylation reagents to the immobilized lipase activity

2.1.2 硅藻土與酶質(zhì)量比對固定脂肪酶活力的影響

由圖2 可知硅藻土與酶的質(zhì)量比越大，固定脂肪酶活力也就越低，應為固定的脂肪酶與大量的硅烷化處理后的硅藻土結(jié)合，酶的活力就相對降低了。

圖2 硅藻土與酶質(zhì)量比對固定脂肪酶活力的影響Fig.2 Impacts of the quality proportion between diatomaceous earth and enzyme to the immobilized lipase activity

2.1.3 固定溫度對固定脂肪酶活力的影響

由圖3 可知隨著溫度的升高固定脂肪酶的活力開始升高，當溫度達到30 ℃后固定脂肪酶活力就不再上升了，由于高溫導致酶失活，酶的最適作用溫度為37 ℃，所以固定脂肪酶時的溫度不宜太高。

圖3 固定溫度對固定脂肪酶活力的影響Fig.3 Impacts of the immobilized temperature to the immobilized lipase activity

2.1.4 固定時間對固定脂肪酶活力的影響

由圖4 可知隨著處理時間的增加，固定脂肪酶活力也隨著增加，當時間達到4 h 時基本不再變化，說明4～6 h 的時間處理使酶與硅藻土緊密結(jié)合即將脂肪酶固定在硅藻土上。

圖4 固定時間對固定脂肪酶活力的影響Fig.4 Impacts of the immobilized time to the immobilized lipase activity

2.2 四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗結(jié)果

2.2.1 回歸方程的建立及顯著性

根據(jù)單因素試驗確定各因素的范圍并進行編碼，因素水平編碼見表1，試驗設計與結(jié)果見表2。

采用Design-Expert.8.0.6 對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到固定脂肪酶的活性（y）與硅烷化試劑添加量（x1）、硅藻土與酶質(zhì)量比值（x2）、溫度（x3）和時間（x4）編碼值的二次回歸方程如下：

y=2 155.39-107.78x1-104.42x2+99.37x3+5.48x4+91.38x1x2-25.79x1x3+40.56x1x4+64.79x2x3+144.95x2x4-172.22x3x4-163.35x12-194.81x22-155.39x32-196.06x42

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of central composite design

同時模型的決定系數(shù)R2=0.860 8，校正R2=0.768 0，說明該模型能解釋76.80%響應值的變化，與實際試驗擬合良好，試驗誤差小，證明應用四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗優(yōu)化硅烷化試劑添加量、硅藻土與酶的質(zhì)量比、固定溫度和固定時間對脂肪酶活性的影響是可行的[10]。

表2 四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal rotating combination test

從表3 中可以得出模型的F 值為9.28，對應的P值＜0.000 1，遠小于0.01，說明模型極顯著，從表3 還可以得出因素一次項（X1、X2和X3）、交互項（X3X4）和二次項（X12、X22、X32和X42）對試驗的結(jié)果影響是極顯著的；交互項（X2X4）也達到了顯著水平。失擬項的P值為0.542 8，遠大于0.05，這說明該模型擬合程度較好，試驗誤差小，所建立的模型是可行的，可以用此模型對固定化酶的工藝條件進行優(yōu)化。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.2.2 響應面分析

從表3 可以得到X2X4（P=0.012 8＜0.05）交互作用顯著和X3X4（P=0.004 0＜0.01）交互作用極顯著，采用降維分析法找出在其他因素條件固定不變情況下，某兩個因素對固定脂肪酶活性的影響，即硅藻土與酶的質(zhì)量比和時間交互作用及溫度和時間的交互作用對固定脂肪酶活性的影響。圖5 和圖6 是Design-Expert 8.0.6 軟件作出的等高線圖及響應曲面圖，對這些因素中交互項之間的交互效應進行分析。

圖5 硅藻土與酶的質(zhì)量比和時間對固定化脂肪酶活力影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Figure of response surface and contour about quality proportion between diatomaceous earth，enzyme and time to the immobilized lipase activity

圖6 溫度和時間對固定化脂肪酶活力影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Figure of response surface and contour about the temperature and time to the immobilized lipase activity

由圖5 可以看出當硅烷化試劑添加量為0.4%，溫度為固定28 ℃時，硅藻土與酶的質(zhì)量比值在2.0～4.0，時間在3.0～5.0 h 范圍內(nèi)顯著增效作用，固定脂肪酶活力隨著兩因素水平的增加而升高。硅藻土與酶的質(zhì)量比值在4.0～6.0，時間在5.0～7.0 h 范圍內(nèi)時，固定脂肪酶的活力隨著兩個因素的增加反而開始降低。由圖6 可知，硅烷化試劑添加量為0.40%，硅藻土與酶的質(zhì)量比值為4 時，溫度在28～32 ℃，時間在5～7 h 范圍內(nèi)存在顯著增效作用，固定脂肪酶活力隨著兩因素水平的升高而增加。溫度在24～28 ℃，時間在3.0～5.0 h 范圍內(nèi)固定脂肪酶活力隨著兩因素水平的升高反而降低。

為了得到最佳的固定化條件值，分析該模型，經(jīng)過分析可知最佳的固定脂肪酶條件為硅烷化試劑添加量為0.35%、硅藻土與酶的質(zhì)量比為3.5∶1、溫度為29 ℃、時間為4.5 h。

2.2.3 驗證性試驗

按上述優(yōu)化的試驗條件進行驗證性試驗，同時也考慮到實際情況，采用硅烷化試劑添加量為0.35%、硅藻土與酶的質(zhì)量比3.5∶1、溫度為29 ℃、時間為4.5 h，此時固定后的脂肪酶活力為2 206.67 U·g-1，與預測的固定脂肪酶活力相對誤差為1.27%，因此響應分析的模型是可靠的。

3 固定化脂肪酶的重復利用

固定前脂肪酶的活力為3 000 U·g-1而在最佳的固定化條件下，測得的固定后脂肪酶活力為2 206.67 U·g-1。雖然酶法在工業(yè)中的應用具有反應條件溫和、操作簡便、易于分離、節(jié)約能源、降低消耗等諸多優(yōu)點。但酶的價格因素限制其在工業(yè)中的應用。因為，固定化后的脂肪酶的使用壽命也被大家廣泛的關注。試驗在正交試驗優(yōu)化出的最佳的試驗條件下，重復使用固定化的脂肪酶，觀察脂肪酶的使用次數(shù)，見圖7。

圖7 使用次數(shù)對固定化脂肪酶活力與DAG 產(chǎn)率的影響Fig.7 Impact of employ frequency to the immobilized lipase activity and DAG rate

由圖7 可知，固定化后的脂肪酶具有良好的操作穩(wěn)定性，連續(xù)使用7 次后，甘二酯的產(chǎn)率依然可以達到50%以上，固定化脂肪酶活力仍可達到1 900 U·g-1以上。這說明多次重復使用后，固定后的脂肪酶仍能保持較好的活性，整個反應體系在上述優(yōu)化條件下有較好的操作穩(wěn)定性，而且本反應體系反應條件溫和，保持了脂肪酶的良好的催化活性。工藝本身可以在一定程度上節(jié)約脂肪酶的使用成本，有著良好的工業(yè)前景和市場前景。

在固化后的脂肪酶回收方面，試驗采用將反應后的混合物于4 000 r·min-1離心20 min，用正己烷溶解下層固定脂肪酶殘留反應物，抽濾分離固定脂肪酶，得到的固定脂肪酶用正己烷反復洗滌3 次，晾干后用于下一次試驗。

4 結(jié)論

通過采用四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設計， 進行響應面分析結(jié)合驗證性實驗確定固定脂肪酶最佳固定化條件為硅烷化試劑添加量為0.35%、硅藻土與酶的質(zhì)量比3.5∶1、溫度為29 ℃、時間為4.5 h，此時固定后的脂肪酶活力為2 206.67 U·g-1。在最佳的固定化條件下，硅烷化試劑添加量、硅藻土與酶的質(zhì)量比和溫度對固定脂肪酶活力影響顯著，因素的主次順序依次為硅烷化試劑添加量、硅藻土與酶的質(zhì)量比、處理溫度、處理時間，該模型顯著，能說明固定的條件對固定脂肪酶活力的關系。

［1］殷傅.米糠油的營養(yǎng)保健功能及其生產(chǎn)工藝探討［J］.江西食品工業(yè)，2000（3）：17-20.

［2］黃莉莉.甘油二酯的功能及安全性研究現(xiàn)狀［J］.國外醫(yī)學衛(wèi)生分冊，2007，34（2）：94-98.

［3］孫德明.米糠綜合利用的開發(fā)研究［J］.農(nóng)林科技，2008（12）：200-20.

［4］韓秀麗，張如意.馬曉健，等.米糠的綜合利用及其前景［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工學刊，2007，7（7）：62-64.

［5］于濟洋，李新華，趙前程，等.甘二酯制備的研究進展［J］.中國油脂，2007，32（11）：12-15.

［6］Nandi S，Gangopadhyay S，Ghosh S.Production of medium chain glycerides from coconut and palm kernel fatty acid distillates by lipase-catalyzed reactions ［J］.Enzyme and Microbial Technology，2005，36（5-6）：725-728.

［7］孟祥河，鄒冬芽，段作營，等.無溶劑體系合成1，3-甘油二酷用脂肪酶的篩選及其酷化性質(zhì)［J］.無錫輕工業(yè)大學學報，2004，23（2）：31-35.

［8］王詩路，趙國明，劉輝，等.固定化脂肪酶催化合成癸二酸二（2-乙基己基）酯［J］.化學反應工程與工藝，2012，28（4）：330-334.

［9］李磊.高酸價米糠油酶法催化制備富含甘油二酯米糠油的研究［D］.無錫：江南大學，2012.

［10］馬萍，郭希娟，李思荻.響應面法優(yōu)化紅小豆中總酚的提?。跩］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2011，23（5）：64-68.