趙培慶 王連慶 李 濤

山東省淄博市中心醫(yī)院中心實驗室，山東淄博255036

間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中長鏈非編碼RNA調(diào)控作用研究進展

趙培慶 王連慶 李 濤

山東省淄博市中心醫(yī)院中心實驗室，山東淄博255036

間充質(zhì)干細胞是一類具有自我更新與定向分化的干細胞，在組織修復與細胞生長發(fā)育中起重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)在間充質(zhì)干細胞的發(fā)育過程中，部分長鏈非編碼RNA表達上調(diào)與下調(diào)，表明它可能是間充質(zhì)干細胞發(fā)育中的重要調(diào)控點，雖然目前該方面的功能性研究比較少，但其強大的研究潛力已經(jīng)體現(xiàn)。

間充質(zhì)干細胞；成骨分化；長鏈非編碼RNA

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新與定向分化能力的細胞，1966首次發(fā)現(xiàn)時被冠以“成纖維祖細胞”之名，目前已經(jīng)證實它可以分化成骨骼、軟骨組織、脂肪組織及肌肉等組織，并且在組織修復及細胞生長調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs通過分泌前列腺素E2（PGE2）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、白細胞介素-1受體拮抗劑（IL-1RA）、白細胞介素-7（IL-7）、白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-11（IL-11）等細胞因子及生長因子來影響免疫微環(huán)境，對損傷的組織進行修復［3］。不同于胚胎干細胞，MSCs屬于成體干細胞，因此不具有無限自我更新和永生化能力［4］。基于以上理論基礎(chǔ)，因此其修復調(diào)控機制顯得尤為重要。

1 lncRNAs的概念及在干細胞發(fā)育分化中的作用

長鏈非編碼RNA（longnoncoding RNAs，lncRNAs）是一類轉(zhuǎn)錄長度大于200 bp的非編碼RNA，有的甚至超過10 kb，可以形成復雜的空間結(jié)構(gòu)，表明它們參與基因表達調(diào)控的分子機制可能更加復雜。根據(jù)它們在基因組中的位置可以分為lincRNA、天然反義鏈lncRNA和內(nèi)含子區(qū)lncRNA［5］。目前已經(jīng)證實它們在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后修飾水平進行調(diào)控，對基因表達調(diào)控、腫瘤診斷及闡述其分子機制方面越來越受到人們的重視。近期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在干細胞多能性及分化等方面起關(guān)鍵調(diào)控作用，Guttman等［6］通過轉(zhuǎn)錄測繪技術(shù)與染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)共發(fā)現(xiàn)40條與多能干細胞功能相關(guān)的lncRNAs，其中有20余條與多能標志物轉(zhuǎn)錄因子（Nanog，oct4）基因表達相關(guān)，表明其在胚胎干細胞分化過程中起重要調(diào)控作用。同時，Chakraborty等［7］也鑒定出3條與維持多能干細胞特性的lncRNAs（Panct1-3）。在心肌細胞發(fā)育分化過程中，Wamstad等［8］也發(fā)現(xiàn)一條在其發(fā)育中起重要表觀遺傳調(diào)控作用的lncRNA。以上研究結(jié)果顯示，lncRNAs在干細胞的生長發(fā)育及分化過程中起重要調(diào)控作用，研究其調(diào)控過程及發(fā)現(xiàn)新的長鏈非編碼RNA勢必為干細胞相關(guān)研究找到新的途徑和方法。

2 間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中可能的最新調(diào)控策略

MSCs作為骨髓成骨細胞前體的重要來源，其分化增殖的時空特異性受到嚴格的調(diào)控。一般情況下，骨髓MSCs受遺傳和表觀遺傳機制調(diào)控，但具體的分子機制有待闡明，MSCs向成骨細胞分化主要涉及以下幾種信號傳導通路：TGF6信號通路、MAPK通路、Runx/osteorix信號通路、Notch通路、Wnt通路等［9］。國外學者研究發(fā)現(xiàn)，如miR-125、miR-141及-200、miR-23等microRNA可通過抑制通路中Runx2蛋白等關(guān)鍵分子的表達對MSCs向成骨分化起抑制作用［10-11］；相反，miR-2861、miR-148b等［12-13］可通過激活成骨通路中關(guān)鍵分子，對成骨作用起正向調(diào)控。這些MSCs成骨調(diào)控因子構(gòu)成一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對其成骨過程進行精細調(diào)節(jié)。已有研究證實lncRNAs可作為一種競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與其他RNA轉(zhuǎn)錄本競爭相同的microRNA，從而抑制microRNA對其靶基因的調(diào)控，但其在MSCs成骨作用中調(diào)控microRNA的具體機制目前還未見報道。Ye等［14］發(fā)現(xiàn)，組蛋白去甲基化酶KDM4B和KDM6B通過消除H3K9me3和H3K27me3甲基化修飾對MSCs成骨分化進行調(diào)控，表明通過表觀遺傳學機制，KDM4B和KDM6B可作為治療靶點來控制MSCs分化過程，可為骨質(zhì)疏松癥等骨代謝疾病治療找到新的線索。近期，研究發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)化生長因子β途徑抑制劑（smallmolecular SB431542）可快速誘導胚胎干細胞產(chǎn)生MSCs［15］，這一發(fā)現(xiàn)表明MSCs可通過大量生產(chǎn)應(yīng)用于臨床治療與修復，但其中的具體調(diào)控分子機制目前還不是十分明確。體內(nèi)炎癥微環(huán)境對MSCs的調(diào)節(jié)也非常重要，微環(huán)境中的免疫細胞和炎癥因子可以活化MSCs，誘導其免疫調(diào)節(jié)功能。最近Dang等［16］學者發(fā)現(xiàn)炎癥因子誘導的自噬可以對MSCs免疫功能產(chǎn)生影響，該發(fā)現(xiàn)使MSCs的臨床治療產(chǎn)生新的期望?？傊?，闡明MSCs的調(diào)控機制可對臨床治療及其成骨分化調(diào)控產(chǎn)生重大影響，lncRNAs作為近期發(fā)現(xiàn)的基因“富礦”，雖然在調(diào)控MSCs方面報道較少，但它應(yīng)該在其細胞分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

3 lncRNAs對間充質(zhì)干細胞的調(diào)控作用

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的普及，lncRNAs的重要功能逐漸受到重視，lncRNAs可通過影響基因表達、表觀遺傳學修飾、蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)等方式對生命活動進行調(diào)控。

在MSCs向軟骨分化過程中，Wang等［17］發(fā)現(xiàn)有3638個lncRNAs有較大程度的變化（2166個表達上調(diào)及1472個下調(diào)），作者選擇了兩個表達上調(diào)的lncRNA ZBED3-AS1和CTA-941F9.9進一步分析驗證，結(jié)果表明它們在誘導分化后的第28天仍然持續(xù)高表達，提示可能參與了MSCs向軟骨分化的全過程。羅嘉全等［18］利用生物分析軟件分析了在MSCs成骨過程中成骨基因Smurf1、MSX1、BMP1相關(guān)的lncRNAs，包括uc003ups、AK096529、AK024937、AKl29811和K056311等。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)lncRNAs在MSCs成骨分化后其表達均較分化前下調(diào)，其中3個lncRNAs（AK096529、uc003ups、AK056311）變化有統(tǒng)計學意義。其可能的機制是通過正向調(diào)控Smurf1，促使Smurf1表達下調(diào)，進而減少Runx2的降解，最終促進MSCs的成骨過程。左長清等［19］用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了116個在MSCs成骨過程中差異表達的lncRNAs，細胞實驗進一步證實lncRNA AK089560的表達值在C3H10T1/2細胞成骨分化的第2，4，6天明顯下降，可能的機制是它參與維持MSCs處于未分化狀態(tài)；進一步分析發(fā)現(xiàn)［20］，116個表達變化的lncRNAs中59個表達上調(diào)，57個則是表達下調(diào)；其中60.3%是基因間結(jié)構(gòu)區(qū)域，另20.7%是位于編碼區(qū)域；且24個lncRNAs都能找到相應(yīng)的毗鄰編碼基因所匹配，提示它們可能是lncRNAs的調(diào)控目標基因。例如EGFR是成骨促進因子Runx2和Osterix的抑制物，小鼠lincRNA0231可通過調(diào)控表皮生長因子受體信號通路來負向影響成骨過程；lncRNA NR_027652則通過影響DLK1、lincRNA0243通過影響IL-5參與了MSCs的成骨過程。程晨等［21］發(fā)現(xiàn)在MSCs成骨過程中表達明顯下調(diào)的lncRNAs有24條，細胞實驗進一步證實其中AK035085可能通過對成骨過程中關(guān)鍵基因抑制來起作用。Wang等［22］同樣用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些在成骨分化過程中的重要lncRNAs，最終證實lncRNA H19和uc022axw.1的表達上調(diào)可能參與了MSCs成骨分化的過程。Zhu等［23］報道，lncRNA-ANCR可以維持成骨細胞的非分化狀態(tài)，其分子機制主要是通過與EZH2作用來抑制Runx2蛋白的表達，從而導致成骨分化降低；相反，下調(diào)lncRNAANCR則可促進成骨分化。

MSCs在不同的解剖區(qū)域有不同的生物學活性，Dong等［24］據(jù)此通過芯片分析了骨髓中MSCs和牙周韌帶干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）中的lncRNAs表達差異情況，發(fā)現(xiàn)了457個表達上調(diào)及513個表達下調(diào)的lncRNAs。某些lncRNAs在PDLSCs中高表達，如NR 045555、NR 033651和NR 027621；另外一些則相比骨髓MSCs低表達，如NR 037182、NR 037595和XR 111050。作者還同時檢測了相關(guān)的mRNA表達情況，并用生物信息學技術(shù)構(gòu)建起一個lncRNAs-mRNA模型，分析發(fā)現(xiàn)，這些lncRNAs可能通過影響相關(guān)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平進而影響了諸如凋亡、MAPK、Wnt等復雜的信號通路，最終影響到細胞的凋亡、增殖與分化過程，它們很可能也參與了MSCs的成骨分化進程。

有報道稱MSCs細胞有致瘤傾向，Shoshani等［25］發(fā)現(xiàn)lncRNA H19高表達，則這種傾向更明顯，表明lncRNA H19可能在其成瘤分化中起到正向調(diào)控作用，它也可以成為MSCs致瘤過程中的一個潛在治療靶點；Liu等［26］的研究成果表明lncRNA HOTAIR也參與了表皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程。在骨髓瘤細胞向MSCs轉(zhuǎn)化過程中，lncRNA MALAT1可通過影響LTBP3基因表達參與了整個轉(zhuǎn)化過程［27］。這些研究一定程度上拓展了人們對lncRNAs在MSCs生物學功能影響方面新的認識。

4 小結(jié)與展望

基因的經(jīng)典功能是編碼對細胞生命活動至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，但是占基因絕大部分的非蛋白編碼序列則是由包括micro RNAs、lncRNAs等在內(nèi)的調(diào)控序列組成。隨著二代測序技術(shù)和生物信息學技術(shù)的不斷成熟，大量的lncRNAs被發(fā)掘出來，初期的研究成果已經(jīng)表明，lncRNAs參與了細胞分化、個體發(fā)育等重要生命活動的整個調(diào)控過程，并與人類的諸多重大疾病密切相關(guān)。DNA元件百科全書（encyclopedia ofDNA elements，ENCODE）計劃已經(jīng)在人類基因組中鑒定了9000余條lncRNAs，但其中具有明確生物學功能的僅有100條左右［28］，大量的基因“富礦”有待人類去開發(fā)。

相比其他細胞功能研究，lncRNAs在MSCs中的功能研究少之又少。但毋庸置疑，雖然前期研究僅停留在生物芯片與生物信息學分析層面，其強大的研究潛力已經(jīng)呈現(xiàn)出來?；趌ncRNAs在生命領(lǐng)域的強大功能，隨著新的研究技術(shù)體系的建立，lncRNAs在調(diào)控間充質(zhì)干細胞分化、增殖、凋亡等重要生命活動中的確切分子機制最終將得以闡釋。

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Progress on the regulate process of long non-coding RNA in osteogenic differentiation ofmesenchymal stem cell

ZHAO Peiqing WANG Lianqing LITao
Department of Central Laboratory,Zibo Central Hospital,Shandong Province,Zibo 255036,China

Mesenchymal stem cell,one type of self-renewal and directed differentiation of stem cells,plays important roles in the tissue repair and cell growth.Recently,researchers have found thatmany long non-coding RNAs up and down regulated in the process ofmesenchymal stem cell development,which means it as an important regulatory point may plays important functions in the development ofmesenchymal stem cell.Although the researches are little focused on the functional studies,its potential prospect has been valued.

Mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;Long non-coding RNA

R34

A[文獻標識碼]1673-7210（2015）06（c）-0035-04

2015-03-31本文編輯：蘇暢）

山東省自然科學基金（ZR2014HM042）。

趙培慶（1977.3-），男，碩士；研究方向：骨質(zhì)疏松相關(guān)免疫機制。

李濤（1970.6-），男，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師；研究方向：骨質(zhì)疏松與骨礦鹽代謝。