束方鵬周 僉呂道均雷 斌周許敏毛向明**. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院泌尿外科（廣東廣州 5055）; . 江西省豐城市中醫(yī)院

HnRNP LRNP L蛋白在人前列腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義*

束方鵬1周 僉2呂道均1雷 斌1周許敏1毛向明1**
1. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院泌尿外科（廣東廣州 510515）; 2. 江西省豐城市中醫(yī)院

摘要目的 研究hnRNP L蛋白在前列腺癌中的表達(dá)及臨床意義。方法 收集我院2011年1月至2013年5月期間行前列腺癌根治術(shù)后標(biāo)本60例，良性前列腺增生（BPH）組織標(biāo)本40例。采用Western blot及免疫組化法檢測(cè)hnRNP L蛋白在前列腺癌及良性前列腺增生組織中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果Western blot結(jié)果顯示hnRNP L蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯高于良性前列腺增生組織（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果表明hnRNP L蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞核，其在前列腺癌及前列腺增生組織中的陽性表達(dá)率分別為66.7%、17.5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，hnRNP L在前列腺癌組織中的表達(dá)與T分期、臨床分期以及Gleason評(píng)分密切相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 hnRNP L高表達(dá)于前列腺癌組織，與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)關(guān)系，有可能作為前列腺癌早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞前列腺腫瘤; 核不均一核糖核蛋白L; 免疫組織化學(xué); 蛋白質(zhì)印跡法

前列腺癌是威脅男性健康的最常見腫瘤之一，在發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病率居男性腫瘤首位，占全部惡性腫瘤的28%，其死亡率僅次于肺癌[1]。我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率與死亡率雖遠(yuǎn)低于歐美國(guó)家，但近年來隨著人口老齡化、環(huán)境污染和前列腺特異抗原（PSA）篩查的普及，其發(fā)病率呈快速上升趨勢(shì)，已成為影響男性健康的主要因素[2]。據(jù)《北京市2011年健康白皮書》報(bào)道，北京市男性前列腺癌發(fā)病率由2001年的5.53/10萬上升至2010年的16.62/10萬，9年增長(zhǎng)200.5%，年均增長(zhǎng)9.2%。另一項(xiàng)針對(duì)全國(guó)前列腺癌流行病學(xué)研究表明：我國(guó)前列腺癌發(fā)病率呈明顯持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，50歲以上前列腺癌發(fā)病率顯著增加[3]。前列腺癌的發(fā)病率和死亡率具有明顯的種族差異，我國(guó)前列腺癌患者的最大特點(diǎn)是晚期患者多、治療效果較差，究其原因，缺乏縝密的早期篩查、綜合治療不盡規(guī)范是關(guān)鍵[4]。由于前列腺癌發(fā)生存在十分明顯的人種差異，研究中國(guó)人群特異性、個(gè)體化的前列腺癌發(fā)病機(jī)制，尋找有效的早期診斷和治療的分子靶標(biāo)具有重要意義。

目前，前列腺癌的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。而越來越多的證據(jù)表明，RNA的選擇性剪接作為一個(gè)廣泛存在的生物進(jìn)程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。其中，核不均一核糖核蛋白家族（hnRNPs）因具有選擇性剪接作用而在腫瘤發(fā)生中占據(jù)重要位置。核不均一核糖核蛋白L（HnRNP L）作為hnRNPs家族中的一員，近幾年在腫瘤中的研究相繼開展，但是hnRNP L在前列腺癌中的表達(dá)情況及其功能研究在國(guó)內(nèi)外尚無公開報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究hnRNP L在前列腺癌組織中的表達(dá)，探討其與前列腺癌臨床參數(shù)的相關(guān)性，為前列腺癌早期診斷、治療提供新的理論依據(jù)。

材料與方法

一、組織標(biāo)本

60例新鮮前列腺癌組織及40例前列腺增生組織取自南方醫(yī)院2011年1月至2013年5月前列腺癌手術(shù)切除標(biāo)本，均為前列腺腺泡腺癌，患者平均年齡67歲。全部標(biāo)本根據(jù)2010版AJCC-TNM分期：T1期15例；T2期19例；T3期21例；T4期5例，根據(jù) Gleason 評(píng)分系統(tǒng)，7分以下34例，8～10分26例。選取同期40例BPH標(biāo)本作為對(duì)照，平均年齡63歲。所有標(biāo)本均由兩名資深病理醫(yī)師診斷證實(shí)。取材后，一半組織立即置于液氮中保存，一半置于甲醛中固定。

二、主要試劑

抗人h n R N P L的鼠源單克隆抗體（P L laboratories)，抗人GAPDH的鼠源單克隆抗體（欣博盛生物科技有限公司），鏈素抗生物素-過氧化物酶（SP）免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）Western blot

取40mg組織經(jīng)液氮研磨后加入400 μl RIPA裂解液（50 mmol/LTris，150 mmol/LNaCl，1%TritonX-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，1mmol/ LPMSF），離心后吸取上清液。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，用RIPA裂解液調(diào)整蛋白終濃度為5μg/μL。蛋白與上樣緩沖液混勻經(jīng)煮沸變性后，取10μl混合液在10%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用BIO-RAD公司的半干轉(zhuǎn)印儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。半干法轉(zhuǎn)膜條件為24V，200mA，30min。5%脫脂牛奶室溫封閉2h，分別加入抗人hnRNP L的鼠源單克隆抗體（1:1000，3%BSA）或抗人GAPDH的鼠源單克隆抗體（1:2000，3% BSA）于4℃孵育過夜。次日，1XTBST漂洗3次，每次5min，再分別加入相應(yīng)的二抗（1:5000，1% BSA）室溫孵育1h。1XTBST漂洗3次，每次5min，使用ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。使用CareStreamHealth公司的Image Station4000R PRO成像儀檢測(cè)發(fā)光信號(hào)。最后圖像經(jīng)“ImageJ2x”軟件定量后，hnRNP L與GAPDH的灰度值比值用作hnRNP L蛋白表達(dá)水平的組間比較。

（二）免疫組化

10%福爾馬林固定，石蠟包埋的組織塊被切成2μm厚的石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟和水化后，在檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）煮沸2min進(jìn)行抗原修復(fù)。依次滴加3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶（室溫下孵育10min）、 正常山羊血清封閉（室溫下孵育30min）、hnRNP L一抗（1:200，4℃過夜）、生物素標(biāo)記的二抗（室溫下孵育30min）、SP溶液（室溫下孵育10min），最后滴加新鮮配制的DAB進(jìn)行顯色（5min）。顯微鏡下根據(jù)觀察染色情況流水沖洗，終止顯色。蘇木素復(fù)染后進(jìn)行脫水封片。染色表達(dá)評(píng)分方法根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)比例兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)判。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（400×）進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度分級(jí)評(píng)分為：無著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分：棕褐色，3分。陽性細(xì)胞數(shù)比例分級(jí)評(píng)分為：0%，0分；1%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；6%～100%，4分。染色評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分+陽性細(xì)胞數(shù)比例評(píng)分，總評(píng)分：（-）為0～2分；（+）為3分；（++）為4分；（+++）為5～7分。定義（-）、（+）為低表達(dá)，定義（++）、（+++）為高表達(dá)。所有切片均由兩名病理醫(yī)生進(jìn)行雙盲閱片。

四、統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析前列腺癌和BPH組織中hnRNP L蛋白的表達(dá)水平。樣本率的比較采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05（雙側(cè)檢驗(yàn)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Western blot blot檢測(cè)hnRNP LRNP L蛋白的表達(dá)水平

Western blot所得圖像用“ImageJ2x”軟件作灰度值分析，用hnRNP L與GAPDH灰度值的比值表示各樣本中hnRNP L蛋白表達(dá)強(qiáng)度，計(jì)算出相對(duì)表達(dá)值。結(jié)果顯示前列腺癌組織中hnRNP L蛋白的表達(dá)量為0.626±0.190，良性前列腺增生組織為0.255±0.100，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002，圖1）。

圖1 hnRNP L 蛋白在前列腺癌（C）和良性前列腺增生組織（N）中Western bblloott結(jié)果

二、免疫組化檢測(cè)HnRNP LRNP L蛋白在前列腺癌及BPH組織中的表達(dá)

HnRNPL蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，呈彌漫性分布（見圖2）。HnRNPL蛋白在前列腺癌組織中多數(shù)呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為66.7%（40/60）；在良性

PH組織中hnRNP L蛋白顯色的陽性細(xì)胞數(shù)及顯色強(qiáng)度較前列腺癌組織明顯減少及降低，在少數(shù)良性BPH組織中呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為17.5%（7/40），兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

三、hnRNP LRNP L蛋白在前列腺癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

60例前列腺癌組織中，hnRNP L蛋白的表達(dá)與T分期、臨床分期及Gleason評(píng)分密切相關(guān)；其中，T1-T4 期hnRNP L蛋白的陽性表達(dá)率分別為46.7 %（7/15）、2.6（10/19）、90.5%（19/20）及80.0%（4/5），組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Gleason評(píng)分≤7分及8～10分的患者中，hnRNP L蛋白的陽性表達(dá)率分別為55.9%（19/34）、80.8%（21/26），組間比較差異有顯著性（P＜0.05）。臨床分期為Ⅱ期、Ⅲ期及IV期患者中，hnRNP L蛋白的陽性表達(dá)率分別為50.0%（16/32）、82.4%（14/17）、90.9（10/11），組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。然而，hnRNP L蛋白表達(dá)與患者年齡無明顯相關(guān)性（表2）。

討 論

HnRNP L為hnRNPs家族成員，參與染色體重塑、RNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)翻譯以及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[5-7]。近年來研究表明hnRNP L表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中，Yau等[8]研究表明hnRNP L 蛋白高表達(dá)于肝癌組織，其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及侵襲相關(guān)。Goehet等[9]研究表明hnRNP L參與調(diào)控肺癌的成瘤能力。D'Agostino等[10]研究表明hnRNP L可能與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。然而，關(guān)于hnRNP L表達(dá)是否與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，目前尚缺乏相關(guān)研究報(bào)道。

圖2 hnRNP L 蛋白在前列腺癌和良性前列腺增生組織中免疫組化染色結(jié)果

表1 hnRNP L 在前列腺癌和BBPPHH組織中的表達(dá)

表2 前列腺癌中hnRNP LRNP L的表達(dá)與相關(guān)臨床病理特征的關(guān)系

本研究中，我們通過Western blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了hnRNP L在60例前列腺癌及40例良性前列腺增生組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示hnRNP L在前列腺癌中的表達(dá)明顯高于前列腺增生，提示hnRNP L表達(dá)可能與前列腺癌的發(fā)生相關(guān)，hnRNP L高表達(dá)可能有助于前列腺癌的發(fā)生。進(jìn)一步結(jié)合前列腺癌患者的臨床病理資料，我們發(fā)現(xiàn)hnRNP L在前列腺癌中的表達(dá)與T分期相關(guān)，提示hnRNP L與腫瘤的大小相關(guān)，hnRNP L高表達(dá)可能有助于腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，hnRNP L表達(dá)與臨床分期及Gleason評(píng)分呈明顯正相關(guān)，提示hnRNP L表達(dá)可能與前列腺癌患者的病情進(jìn)展相關(guān)，影響患者的預(yù)后，這與hnRNP L在肝癌中的報(bào)道較為相符。

hnRNP L是一種RNA結(jié)合蛋白，參與染色體重塑、轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)控以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)生物進(jìn)程[11]，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用值得重視。關(guān)于hnRNP L在前列腺癌中的作用機(jī)制尚不清楚。目前研究已報(bào)道hnRNP L在其它腫瘤中的可能作用機(jī)制。其中，Goehet等[9]研究表明hnRNP L通過對(duì)caspase-9 Pre-RNA的加工，影響非小細(xì)胞肺癌的腫瘤形成。Lee等[12]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中，hnRNP L與內(nèi)源性Bcl-2 mRNA具有相互作用關(guān)系。Jafarifar等[13]發(fā)現(xiàn)hnRNP L可調(diào)控與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF-A）。近期有研究表明：hnRNP L 和lncRNA-THRIL可形成功能復(fù)合體并與TNFα啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，通過調(diào)節(jié)Toll受體信號(hào)通路中的髓樣分化因子MyD88，達(dá)到調(diào)控TNFα基因轉(zhuǎn)錄的作用[14]。HnRNP L已被證實(shí)參與細(xì)胞凋亡，RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等生物進(jìn)程，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，然而關(guān)于hnRNP L在前列腺癌中的作用機(jī)制仍有待于后續(xù)的深入研究。

總之，本研究結(jié)果顯示hnRNP L蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著高于良性前列腺增生組織，且其表達(dá)與前列腺癌的T分期、臨床分期及Gleason評(píng)分密切相關(guān)，提示hnRNP L可能參與了前列腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程，并有望成為臨床前列腺癌早期診斷的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，關(guān)于hnRNP L在前列腺癌中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制，仍有待于后續(xù)的研究證實(shí)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（2014-12-20收稿）

**通訊作者, E-mail: 13691903635@126.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.003

中圖分類號(hào)R 737.25

*基金項(xiàng)目資助: 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2013B021800147）；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：JCYJ20140415162542992）

Expression of hnRNP L protein in human prostate cancer tissues and its clinical signifi cance*

Shu Fangpeng, Zhou Qian2, Lv Daojun, Lei Bin, Zhou Xuming, Mao Xiangming**
1. Department of Urology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;
2. Traditional Chinese Medicine Hospital, Fengcheng, Jiangxi Province
Corresponding author: Mao Xiangming, E-mail: 13691903635@126.com

AbstractObjective To Investigate the expression of hnRNP L in human prostate cancer and explore its clinical signifi cance. Methodsthods Sixty cases of prostate cancer and 40 cases of benign prostate hyperplasias in our hospital during January, 2011 and May, 2013 were enrolled in this study. The expression of hnRNP L protein in prostate cancer tissues and benign prostate hyperplasias tissues was detected by Western blotting and immunohistochemistry (IHC), respectively. Meanwhile, the correlation between hnRNP L expression and clinical pathological characters was analyzed. Results ults Western blotting analysis showed that hnRNP L expression in prostate cancer tissues was signifi cantly higher than that in in benign prostate hyperplasias tissues (P＜0.05). IHC analysis demonstrated that positive expression of hnRNP L was located in nuclear of cells, and the positive rates of hnRNP L in prostate cancer and benign preostate hyperplasias were 66.7% and 17.5%, respectively, with a signifi cant difference (P＜0.05). Moreover, hnRNP L expression was positively correlated with T stage, clinical stage and Gleason score in prostate cancer (P＜0.05). Conclusionusion hnRNP L is highly expressed in prostate cancer tissues, and correlated with tumor occurrence and development, which may be served as effective molecular marker or therapeutic target in prostate cancer.

Key wordsords prostatic neoplasms; Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoprotein L; immunohistochemistry; Western Blotting