白雙勇王劍松**趙慶華. 昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科（昆明 650000）; . 昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院婦科

超重及肥胖男性不育患者精子早期凋亡研究*

白雙勇1王劍松1**趙慶華2
1. 昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科（昆明 650000）; 2. 昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院婦科

摘要目的 為進一步了解超重及肥胖對男性生育力影響，探究男性不育患者精子早期凋亡發(fā)生情況及原因。方法 通過隨機抽樣抽取對照組26人；男性不育患者26人，其中超重不育組12人；肥胖不育組14人。入選對象完成精液常規(guī)及Annexin V-FITC/PI雙染精子，流式細胞儀檢測精子早期凋亡率，酶聯(lián)免疫法ELISA檢測精漿中活性氧、谷胱甘肽過氧化物酶檢測。結果 精子早期凋亡率超重不育組（15.73±6.49）%與對照組（10.48±6.21）%相比，高于后者，差異有顯著性（P＜0.05）。肥胖不育組（16.16±6.57）%與對照組相比，高于后者，差異有顯著性（P＜0.05）。超重不育組和肥胖不育組相比，兩者差異無顯著性（P＞0.05）。體質(zhì)指數(shù)與精子活動率負相關（R=-0.31，P＜0.05），與不動精子率呈正相關（R=0.31，P＜0.05），與精子早期凋亡率呈明顯正相關（R=0.41，P＜0.01）。活性氧與精子早期凋亡率呈正相關（R=0.61，P＜0.01），谷胱甘肽過氧化物酶與精子早期凋亡率呈負相關（R=-0.46，P＜0.01）。結論 超重及肥胖男性不育患者精漿中活性氧水平增高，而谷胱甘肽過氧化物酶下降導致精子早期凋亡率增高，導致超重、肥胖影響男性不育原因之一。

關鍵詞人體質(zhì)量指數(shù); 精子; 細胞凋亡; 不育, 男性

Key woorrddss body mass index; spermatozoa; apoptosis; infertility,male

隨著發(fā)達國家肥胖率上升，肥胖與生育之間的相互作用也逐漸引起人們的重視。肥胖導致男性不育的機制有多方面，包括：促性腺激素、雄激素下降，雄激素和雌激素轉化異常，胰島素抵抗、睡眠障礙等[1]，肥胖男性精子數(shù)目減少，精子活力下降等[2]，成人精子凋亡對于調(diào)節(jié)精子生成是非常重要的機制，通過凋亡可以使本身異常的精子細胞不繼續(xù)發(fā)展為成熟精子，可以避免將有遺傳缺陷傳遞給下一代，如果凋亡率過高則導致其生育力下降。精漿中活性氧（reactive oxygen species，ROS）在低水平時可以調(diào)節(jié)精子生理功能包括：精子獲能、頂體反應，線粒體鞘穩(wěn)定性和精子的運動性。但是過量的ROS及其代謝產(chǎn)物可能損傷DNA、脂質(zhì)、蛋白，改變酶系統(tǒng)，引起細胞凋亡增加。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，它能催化GSH變?yōu)镚SSG，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害。本次研究目的是探討在超重及肥胖男性精子凋亡與精漿中ROS、GSH-Px 之間的關系，為臨床超重、肥胖男性不育診斷及治療提供一定基礎。

材料和方法

一、一般資料

本研究獲昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會同意，參與的患者都被告知相應的權利。2013年4月至10月在昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院生殖中心就診人群中隨機抽取男性。男性不育癥標準為：有規(guī)律性生活未避孕一年而未使妻子受孕的男性。男性年齡最小不小于21歲，年齡最大不超過50歲。排除標準：與超重/肥胖無關的疾病或異常病史（包括：精索靜脈曲張，隱睪癥，腫瘤，男性絕育術，睪丸扭轉）；嚴重附屬性腺炎癥；有生育毒性物接觸史如農(nóng)藥廠工人；為進一步研究體質(zhì)指數(shù)對男性生育力的影響，嚴重少弱精癥和無精子癥也排出。選取來門診檢查準備生育二胎正常體重男性26人為正常對照組，超重不育男性12人，肥胖不育男性14人。

二、方法

（一）精液分析

所有參與課題男性禁欲48～72h后，通過手淫辦法獲取精液，嚴格按照世界衛(wèi)生組織2010年第五版人類精液檢驗與處理實驗室手冊要求，由昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院男科實驗室工作人員按操作規(guī)程精液常規(guī)分析。

（二）分組

所有患者著輕便衣服，不穿鞋情況下測量身高和體重。身高為站立位足底到頭部最高點垂直距離，單位m。體重為人體的總重量，單位kg。體重指數(shù)（body mass index, BMI）=體重（kg）/身高（m）2。根據(jù)中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會2013 年10月1日實施衛(wèi)生行業(yè)標準，成人男性正常體重指數(shù)為24.00＞BMI≥18.5；超重為28.00＞BMI≥24.0；肥胖組為BMI≥28.0。

（三）制備單細胞懸液

調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，1000×g ，離心5min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。 取5～10萬重懸的細胞，1000×g離心5min，棄上清，使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購于嘉美紐諾（北京）生物科技有限公司。加入195μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入5μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫（20～25℃）避光孵育10min?？梢允褂娩X箔進行避光。1000×g離心5分鐘，棄上清，加入190μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入10μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴且避光放置，避光孵育15min，1h內(nèi)進行流式檢測。

（四）流式細胞儀檢測

激發(fā)光波長為488nm，用525nm的帶通濾片檢測FITC，用610nm的帶通濾片檢測PI。分別通過FITC和PI對數(shù)熒光直方圖或散點圖分析活細胞、凋亡細胞和壞死細胞百分率。對照設定：（1）單純活細胞，不加AnnexinⅤ和PI；（2）活細胞只加AnnexinⅤ，不加PI；（3）活細胞只加PI，不加AnnexinⅤ；（4）已知凋亡的細胞系作為陽性對照；已知未凋亡的細胞系作為陰性對照。

（五）檢測精漿中ROS、GSH-Px

經(jīng)過精液常規(guī)分析檢測后的精液標本經(jīng)2000g離心25分鐘獲取精漿，行酶聯(lián)免疫法ELISA（上海欣樂生物有限公司試劑盒）檢測精漿中ROS、GSH-Px。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件導入數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)分析,各組數(shù)據(jù)以（x±s）表示， 通過單因素ANOVA比較，LSD分析各組間差異。Person相關性分析檢測各因素之間的相關性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

表1中對照組、超重組、肥胖組在年齡，精液量、精子濃度、精子活動率、前向運動率、不動精子率、畸形率、精液中白細胞數(shù)等方面均無顯著性差異（P＞0.05）。在精子早期凋亡率的比較中超重組（15.73±6.49）%與對照組（10.48±6.21）%相比，高于后者，差異有顯著性（P＜0.05）。肥胖組（16.16±6.57）%與對照組相比較，高于后者，差異有顯著性（P＜0.05）。超重組和肥胖組相比，兩者差異無顯著性（P＞0.05）。在精子晚期凋亡及壞死率的比較中對照組（18.52±10.85）%、超重不育組（19.20±13.16）%、肥胖不育組（18.67±9.01）%，3者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 超重、肥胖男性不育患者精液分析、早期凋亡及精漿中ROS、GSH-PxSH-Px比較（x±sxs）

精漿中ROS各組比較中超重組（576.13± 90.76）高于對照組（415.94±147.72），差異有顯著性（P＜0.05）。肥胖組（1050.82±179.00）高于對照組，差異有顯著性（P＜0.05）。肥胖組高于超重組，差異有顯著性（P＜0.05）。精漿中GSH-Px各組比較中超重組（91.20±22.43）低于對照組（130.24± 7.11）, 差異有顯著性（P＜0.05）。肥胖組（67.58± 6.12）低于對照組，差異有顯著性（P＜0.05）。肥胖組低于超重組，差異有顯著性（P＜0.05）。

表2中，年齡、體質(zhì)指數(shù)、精漿中ROS、GSH-x與精液常規(guī)各項指標、精子早期凋亡率相關性分析中，年齡與精子各項指標、早期凋亡率之間無相關性。體質(zhì)指數(shù)與精液分析中精子活動率負相關（R=-0.31，P＜0.05），與不動精子率呈正相關（R=0.31，P＜0.05），體質(zhì)指數(shù)與精子早期凋亡率呈正相關（R=0.41，P＜0.01）。與精液其他各項指標無相關性。體質(zhì)指數(shù)與精漿中活性氧呈正相關（R=0.77，P＜0.01），而與精漿中谷胱甘肽過氧化物酶呈負相關（R=-0.69，P＜0.01）?；钚匝跖c精子早期凋亡率呈正相關（R=0.61，P＜0.01），谷胱甘肽過氧化物酶與精子早期凋亡率呈負相關（R=-0.46，P＜0.01）。

表2 年齡、BMIBMI、精漿中ROS、GSH-PxSH-Px與精液各項指標相關性分析

討 論

肥胖影響男性生育機制可能主要在于改變男性激素內(nèi)分泌以及精子遺傳方式。目前有關肥胖與精子生成之間的研究多種，但是其結果常常不一致，Macdonald等[3]在其Meta分析中未發(fā)現(xiàn)BMI增加與精液各項指標改變有相關性。Eisenberg等[4]研究結果認為：隨著BMI增加男性射精量減少，精子總數(shù)也與BMI呈負相關性，但是BMI與精子濃度、活動率、形態(tài)、精子DNA碎片指數(shù)無相關性。Sermondade 等[5]Meta分析結果認為在超重、肥胖男性發(fā)生少、弱精癥的幾率高于正常體重男性，兩者之間存在J形關系。Shaha[6]研究認為超重和肥胖男性精子活動率及精子總數(shù)均低于正常BMI男性，精子活動率與BMI呈負相關性。而本次研究結果中，BMI與精子活動率呈負相關性，與精子不活動率呈正相關。本次研究結果與Sermondade等不盡相同，而與Shaha結果相似。

凋亡對于生殖細胞從其胚胎性腺分化早期階段就有調(diào)節(jié)生殖細胞分化數(shù)目及功能的作用。成人精子凋亡后可以將有損傷的生殖細胞從曲細精管中清除，不再繼續(xù)發(fā)展成為精子，保持遺傳穩(wěn)定[6]。一般在成人睪丸組織有25%～75%生殖細胞發(fā)生凋亡，精子發(fā)生自發(fā)凋亡在精子發(fā)生異常時起著重要調(diào)節(jié)和自我修復的作用。在細胞凋亡的早期階段，細胞膜的脂質(zhì)分布不對稱性喪失，但胞膜結構仍然完整。位于細胞質(zhì)膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）轉移到膜外, 此過程的發(fā)生一般早于細胞核的改變。Erdemir等[7]研究發(fā)現(xiàn)隨著體重增加，肥胖雄性小鼠血清中活性氧增加，可能是導致雄性小鼠生育力下降原因之一。精液中ROS產(chǎn)生主要是來自白細胞和精子。過量產(chǎn)生的ROS可以損傷細胞和組織，由于精子細胞膜富含不飽和脂肪酸而細胞質(zhì)內(nèi)僅有少量酶可以中和ROS，很容易受到ROS的損傷。ROS導致精子細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化可以誘發(fā)精子凋亡的發(fā)生增加，細胞膜脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生親電子醛基可以降低精子運動能力。呂毅清等人研究發(fā)現(xiàn)[8]正常男性精子早期凋亡率為（3.52±1.88）%，在精索靜脈曲張和白細胞精液組精子凋亡率均增加。Aitken[9]研究發(fā)現(xiàn)精子遭受氧化損傷的過程中，精子DNA修復缺乏體細胞DNA修復機制，通過內(nèi)切酶切除受損堿基，從而修復損傷的DNA。由于精子DNA損傷后修復能力較差，則精子DNA受損后，精子早期凋亡增加。在精子生成的微環(huán)境中，有相應的抗氧化系統(tǒng)，包括酶系和非酶抗氧化成分，精液中的主要抗氧化酶系統(tǒng)被稱為由超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶。精漿中GSH-Px來自前列腺，主要定位于線粒體基質(zhì)中，參與精子染色質(zhì)壓縮和保護精子免于ROS的損害。當精漿中GSH-Px下降，則其抗氧化能力下降，則精子凋亡增加[10]。

在本次研究結果中發(fā)現(xiàn)，超重不育組及肥胖組精漿中ROS均高于對照組，差異有顯著性。而且隨著BMI增加，精漿中ROS水平上升，BMI與ROS之間呈正相關。與之相反超重不育組及肥胖不育組精漿中GSH-Px水平均低于對照組，差異有顯著性，隨BMI增加精漿中GSH-Px降低，BMI與GSH-Px之間呈負相關。在精子早期凋亡率的比較中，超重組與對照組相比，高于后者，差異有顯著性。肥胖組與對照組相比較，高于后者，差異有顯著性。超重組和肥胖組相比，兩者差異無顯著性。精子早期凋亡率與BMI及精漿中ROS呈正相關，而與精漿中GSH-Px呈負相關。結果顯示，隨著男性BMI增加，由于精漿中ROS增加，而精漿中GSH-Px降低，則誘發(fā)精子凋亡損害因素增加，而保護性因素降低，最終導致超重及肥胖男性不育患者精子早期凋亡率增加，精子早期凋亡率增高則精卵結合幾率降低，男性生育力降低?？赡苁菍е鲁丶胺逝帜行圆挥颊呱ο陆档脑蛑?。而臨床治療應該注重考慮糾正男性肥胖才能有效提高男性生育力。肥胖男性不育患者精子早期凋亡率增高其原因是多方面的，還需要進一步去研究。本次研究結果還需要擴大臨床樣本去證實，以及完善更深入的機制探究。

參 考 文 獻

1 Hammoud AO, Meikle AW, Reis LO, et al. Obesity and male infertility: a practical approach. Semin Reprod Med 2012; 30(6):486-495

2 Sermondade N, Faure C, Fezeu L, et al. BMI in relation to sperm count: an updated systematic review and collaborative meta-analysis. Hum Reprod Update 2013; 19(3): 221-231

3 Macdonald AA, Stewart AW, Farquhar CM. Body mass index in relation to semen quality and reproductive hormones in New Zealand men: a cross-sectional study in fertility clinics. Hum Reprod 2013; 28(12): 3178-3187

4 Eisenberg ML, Kim S, Chen Z, et al. The relationship between male BMI and waist circumference on semen quality: data from the LIFE study.Hum Reprod 2014; 29(2): 193-200

5 Sermondade N, Faure C, Fezeu L, et al. BMI in relation to sperm count: an updated systematic review and collaborative meta-analysis. Hum Reprod Update 2013; 19(3): 221-231

6 Shaha C, Tripathi R, Mishra DP. Male germ cell apoptosis: regulation and biology. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2010; 365(1546): 1501-1515

7 Erdemir F, Atilgan D, Markoc F, et al. The effect of dietinduced obesity on testicular tissue and serum oxidative stress parameters. Actas Urol Esp 2012; 36(3): 153-159

8 呂毅清, 陳斌, 胡凱, 等. 精子凋亡率與精子密度、活率、活力及活性氧關系探討. 中國男科學雜志 2009; 23(2): 34-37

9 Aitken RJ, Baker MA. Causes and consequences of apoptosis in spermatozoa; contributions to infertility and impacts on development. Int J Dev Biol 2013; 57(2-4): 265-272

10 Walczak-Jedrzejowska R, Wolski JK, Slowikowska-Hilczer J. The role of oxidative stress and antioxidants in male fertility. Cent European J Urol 2013;66(1):60-67

（2014-10-18收稿）

**通訊作者, E-mail: jiansongwang@yahoo.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.002

中圖分類號R698. 2

*基金項目資助: 國家自然科學基金（81260374）

Study on early sperm apoptosis in male infertility with overweight and obesity*

Bai Shuangyong1, Wang Jiansong1**, Zhao Qinghua2
1. Department of Urology, The second affi liated Hospital, Kunming medical university, kunming 650000, China; 2. Department of Gynaecology, The second affi liated Hospital, Kunming medical university
Corresponding author: Wang Jiansong, E-mail: jiansongwang@yahoo.com

AbstractObjective To investigate early sperm apoptosis occurrence and infl uence factor for better understand the overweight and obesity in male fertility. Metthhooddss Semen samples were collected from 26 normal males(the control group) and 12 male infertility patients with overweight(overweight group), as well as 14 male infertility with obesity( obesity group). Semen routine analysis was carried out. Early apoptosis of sperm was detected by fl ow cytometry. Levels of reactive oxygen species and glutathione peroxidase in the seminal plasma were assayed by ELISA. Ressuullttss Early apoptosis rates of sperm in overweight group (15.73±6.49) % and obesity group (16.16±6.57) % were all signifi cantly higher than that in the control group (10.48±6.21) % (P＜0.05), but there was no signifi cant difference in early apoptosis rate between overweight group and obese group (P＞0.05). Body mass index (BMI) was negatively related with the rate of sperm activity in semen analysis (R =- 0.31, P＜0.05), and positively correlated with the inactivity rate of sperm (R = 0.31, P＜0.05) and early apoptosis rate of sperm (R = 0.41, P＜0.01). Reactive oxygen species was positively correlated with early apoptosis rate of sperm (R = 0.61, P＜0.01), glutathione peroxidase and early apoptosis rate of sprm showed a negative correlation (R =-0.46, P＜0.01). Concluussiioonn The level of reactive oxygen species in seminal plasma were increased in male infertility with overweight and obesity, and low level of glutathione peroxidase caused early apoptosis of sperm may result in ocurrence of male infertility with overweight and obesity.