鄒青松 梁勝杰 高 原 毛師魁 蒿魁元 夏術(shù)階 韓邦旻上海市第一人民醫(yī)院泌尿外科（上海 200080）

·論 著·

不同年齡段前列腺外周帶基質(zhì)細胞ARAR活性差異對前列腺上皮細胞增殖的影響*

鄒青松 梁勝杰 高 原 毛師魁 蒿魁元 夏術(shù)階 韓邦旻**
上海市第一人民醫(yī)院泌尿外科（上海 200080）

摘要目的 探討年輕和老年前列腺外周帶基質(zhì)細胞AR活性差異及對前列腺上皮細胞的增殖影響。方法 不同年齡段前列腺基質(zhì)細胞給予生理濃度 10nM DHT刺激，熒光素酶報告基因檢測AR轉(zhuǎn)錄活性差異，Elisa檢測AR調(diào)控因子FGF-2，KGF，IGF-1分泌差異。CCK8檢測與BPH-1及LNCaP共培養(yǎng)后BPH-1及LNCaP增殖情況。免疫組化，Q-PCR，Westernblot探究不同年齡前列腺基質(zhì)細胞ARA55表達，慢病毒干擾ARA55，給予10nM DHT刺激，Western-blot檢測基質(zhì)細胞AR表達差異，熒光素酶報告基因檢測基質(zhì)細胞AR轉(zhuǎn)錄活性差異，Elisa檢測FGF-2，KGF，IGF-1分泌差異。CCK8檢測陰性對照組（ARA55-sc）與干擾組（ARA55-sh）與BPH-1及LNCaP共培養(yǎng)后BPH-1及LNCaP增殖情況。結(jié)果 基質(zhì)細胞給予10nM DHT刺激，老年基質(zhì)細胞AR轉(zhuǎn)錄活性、AR調(diào)控細胞因子FGF-2，KGF，IGF-1及對上皮細胞（BPH-1、LNCaP）促增殖高于年輕人（P＜0.05）。老年基質(zhì)細胞ARA55表達高于年輕人。干擾基質(zhì)細胞ARA55后，不同年齡段基質(zhì)細胞AR表達無差異，老年基質(zhì)細胞ARA55-sh較ARA55-sc AR轉(zhuǎn)錄活性、AR調(diào)控細胞因子FGF-2，KGF，IGF-1分泌及對上皮細胞（BPH-1、LNCaP）促增殖降低（P＜0.05），而年輕人基質(zhì)細胞ARA55-sh與ARA55-sc無差異（P＞0.05）。結(jié)論 在10nM DHT刺激下，老年人基質(zhì)細胞AR活性強于年輕人。老年基質(zhì)細胞可能通過高表達ARA55增強AR轉(zhuǎn)錄活性和AR調(diào)控細胞因子分泌，促進BPH-1及LNCaP增殖。

關(guān)鍵詞前列腺腫瘤; 間質(zhì)細胞; 細胞因子類

前列腺癌是一種嚴重威脅男性健康的惡性腫瘤。2013年美國約有238 590例新增前列腺癌病人，并有約29 720人死于前列腺癌，成為危害男性健康第一位的腫瘤。前列腺癌是年齡相關(guān)性疾病，年齡被認為是前列腺癌發(fā)生的高危因素之一，在老年男性中前列腺癌的發(fā)生率逐年增高[1]。基質(zhì)細胞在前列腺癌的發(fā)生，發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，腫瘤發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化都受到部分異?；|(zhì)上皮相互作用機制的調(diào)控[2]。基質(zhì)細胞通過分泌可溶性細胞因子改變前列腺基質(zhì)微環(huán)境進而影響前列腺癌的進展[3]。前列腺為雄激素依賴性器官，雄激素受體（AR）信號系統(tǒng)對于前列腺癌的發(fā)生發(fā)展也起著非常重要的作用，基質(zhì)細胞AR通過調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子的變化影響前列腺上皮的惡變及轉(zhuǎn)移[4]。雄激素在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。然而，隨著年齡增長，前列腺組織中雙氫睪酮的濃度與前列腺癌發(fā)生無明顯相關(guān)性[5]。該研究旨在研究不同年齡段前列腺外周帶基質(zhì)在生理濃度DHT刺激下AR活性差異及對前列腺上皮細胞（BPH-1、NCaP）增殖的影響并研究其相關(guān)機制。

材料和方法

一、材料

PCR引物合成：生工生物工程（上海）有限公司；SYBR Green PCR Master Mix：寶生物工程（大連）有限公司；ARA55抗體為Sata cruz公司，AR，APDH抗體為Abcam公司；CCK-8試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)公司；慢病毒質(zhì)粒為GENECHEM公司；ELISA試劑盒為RNG公司分裝；ABI 7900 型熒光定量PCR 儀：美國應用生物系統(tǒng)公司；Luciferase測定相關(guān)試劑為Promega公司；液體閃爍計數(shù)器Luminometer，Beckman公司。

二、標本

老年人（55～75歲）[6, 7]前列腺標本取自我院因膀胱癌行根治性膀胱全切的患者共5例。tPSA均小于4 g/L，年輕人（23～29歲）前列腺標本取自遺體貢獻者5例。按照McNeal 區(qū)帶解剖法取前列腺外周帶組織塊。

三、方法

（一）免疫組化染色方法

前列腺外周帶標本用10 %甲醛固定24 h , 石蠟包埋，5mm石蠟切片，常規(guī)脫蠟，逐級入水，3 % 過氧化氫孵育，0.01 mmol /L PBS（p H 7.4）沖洗3次，每次3min，熱抗原修復7min，3 %過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，一抗（ARA55 1:100）過夜，PBS 洗3次，每次3min。每張切片加1滴二抗，室溫下孵育20min，PBS 沖洗3 次，每次3 min，中性樹脂封片。

（二）原代細胞培養(yǎng)

前列腺外周帶組織，剪碎至約1mm2，I型膠原酶（200U/mL）于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)消化10h；149 m過濾篩過濾去除組織碎屑；770×g，4℃，離心10min; 棄上清液，加入含10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液5mL，吹打混勻后轉(zhuǎn)移至25cm培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)。

（三）Q-PCR

根據(jù)Trizol試劑說明提取老年和年輕人外周帶基質(zhì)細胞總RNA，紫外分光光度法測定RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄反應試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行Q-PCR，引物序列如下：

ARA55

GAGATGAGGGTTTCCACGAG

CGCCGAGATGTAGTTATCCA

GAPDH

AGAAGGCTGGGGCTCATTTG

AGGGGCCATCCACAGTCTTC

（四）Western-blot

RIPA 裂解液冰上裂解基質(zhì)細胞30min 4℃，10 000×g，10min。用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，總蛋白30mg于8% SDS-PAGE gels電泳。膜封閉后進行抗原抗體反應，顯影定影，分析。兔抗人AR（1:2000），兔抗人ARA55（1:1000），兔抗人GAPDH（1:2000）。

（五）CCK8

基質(zhì)細胞2×104個接種于微孔雙室共培養(yǎng)系統(tǒng)的下室，貼壁后加入無酚紅RPMI-1640 +木炭處理過5%FBS +10nMDHT，空白組下室不接種細胞。BPH-1（或LNCaP）細胞5×103種植于上室，每孔加入無酚紅RPMI-1640 200μL。上下室放在一起。培養(yǎng)箱中連續(xù)共培養(yǎng)1、2、3、4、5d。每上室內(nèi)加入10mg/mL的CCK-8 20μl培養(yǎng)4 h。酶標儀檢測各孔光密度值。

（六）慢病毒干擾

基質(zhì)細胞接種于60mm皿，待細胞密度為30%時，根據(jù)慢病毒干擾說明書干擾ARA55，病毒滴度為102TU/ml，ARA55-sc為陰性對照。病毒轉(zhuǎn)染12h后換液。

（七）雙熒光素酶報告基因

基質(zhì)細胞5×104接種于24孔板，貼壁后根據(jù)Lipofectamine2000說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染。MMTV 500ng，SV-40 5 ng共轉(zhuǎn)染6h后換酚紅處理的1640+木炭處理的55% FBS, 24h收獲細胞，用被動裂解液裂解細胞。用Dual-Luciferase?Reporter Assay System （Promega）和液體閃爍計數(shù)器檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，取兩次讀數(shù)的比值作為相對轉(zhuǎn)錄活性，進行統(tǒng)計學處理。

（八）Elisa

將基質(zhì)細胞2×105接種于6孔板，次日換2ml酚紅處理的1640+木炭處理的5%FBS。48h后收集上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明用雙抗體夾心 ABC-ELISA法檢測細胞因子FGF-2，KGF，IGF-1分泌量。

四、統(tǒng)計學處理（Statistical Analyses）

各組資料以x±s表示，兩組間采用Student T-test進行統(tǒng)計學檢驗，各組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）。P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。所有實驗未標明重復數(shù)目者均為3次重復。

結(jié) 果

一、老年前列腺基質(zhì)細胞ARAR通路活性較年輕人前列腺基質(zhì)細胞高

在10nM DHT刺激24h后，熒光素報告基因檢測發(fā)現(xiàn)：老年基質(zhì)細胞AR轉(zhuǎn)錄活性明顯高于年輕人前列腺基質(zhì)細胞（P＜0.05）（圖1A1A）。DHT刺激基質(zhì)細胞后檢測上清發(fā)現(xiàn)：老年基質(zhì)細胞AR調(diào)控因子FGF-2，KGF，IGF-1分泌高于年輕人基質(zhì)細胞（P＜0.05）（圖1B1B、圖1C1C、圖1D1D）。

圖1 10nM DHT 刺激下，前列腺基質(zhì)細胞AR通路活性

以上結(jié)果說明老年人基質(zhì)細胞AR通路活性較年輕人高，老年人基質(zhì)細胞AR轉(zhuǎn)錄活性及AR調(diào)控因子分泌強于年輕人。

二、老年前列腺基質(zhì)細胞對前列腺上皮細胞促增殖作用高于年輕人基質(zhì)細胞

在10nM DHT刺激下，基質(zhì)細胞與上皮細胞（BPH-1，LNCaP）共培養(yǎng)，年輕人、老年基質(zhì)細胞都可以促進上皮細胞增殖，與上皮細胞單獨培養(yǎng)組第2天出現(xiàn)差異（P＜0.05）。老年基質(zhì)細胞對上皮細胞的促增殖作用高于年輕人基質(zhì)細胞，共培養(yǎng)后第2天出現(xiàn)差異（P＜0.05）（圖2A、圖2B）。

圖2 10nM DHT刺激下, 前列腺基質(zhì)細胞對前列腺上皮細胞增殖影響

以上結(jié)果說明：在10nM DHT刺激下，前列腺基質(zhì)細胞對上皮細胞增殖有促進作用，而老年人基質(zhì)細胞對上皮細胞（BPH-1,LNCaP）的促增殖作用更強。

三、雄激素共調(diào)節(jié)因子ARA55在老年前列腺基質(zhì)細胞中高表達

為了進一步研究老年基質(zhì)細胞AR通路活性高于年輕人基質(zhì)細胞機制，我們研究AR共調(diào)節(jié)因子

RA55在不同年齡段基質(zhì)細胞表達情況。

在臨床前列腺外周帶標本中，我們通過免疫組化發(fā)現(xiàn)ARA55只表達于基質(zhì)細胞，而不表達與上皮細胞，老年前列腺基質(zhì)細胞ARA55染色強于年輕人，且核染細胞明顯多于年輕人（圖3A3A）。

在原代基質(zhì)細胞中，激素刺激對ARA55表達無影響（圖3C3C）。在10nM DHT 刺激下，Q-PCR和Westernblot同樣驗證了老年外周帶基質(zhì)細胞ARA55表達水平高于年輕人（P＜0.05）（圖3B3B、圖3C3C）。

圖3 ARA55在年輕人和老年人前列腺基質(zhì)細胞中表達情況

這提示我們，激素刺激對基質(zhì)細胞ARA55表達量無影響，ARA55特異性表達于前列腺基質(zhì)細胞，老年前列腺基質(zhì)細胞表達量高于年輕人。

四、慢病毒干擾ARA55ARA55后，基質(zhì)細胞AR表達無變化

慢病毒干擾基質(zhì)細胞A R A 5 5后，通過-PCR,Western-blot檢測ARA55干擾效率發(fā)現(xiàn)：干擾基質(zhì)細胞ARA55后，ARA55表達量明顯下降（圖4A、圖4B）?；|(zhì)細胞給予10nmol DHT刺激48h，Western-blot檢測AR表達，年輕人和老年人基質(zhì)細胞AR表達無明顯差異（圖4C4C）。

以上說明慢病毒可以高效干擾基質(zhì)細胞ARA55，干擾ARA55并不影響基質(zhì)細胞AR的表達。

五、干擾基質(zhì)細胞ARA55ARA55后，10nmol DHTl DHT刺激下，老年基質(zhì)細胞ARAR通路活性下降

圖4 基質(zhì)細胞ARA55ARA55干擾效率及干擾后對AR表達的影響

干擾基質(zhì)細胞ARA55后，在10nmol DHT激素刺激下，老年基質(zhì)細胞A R A 5 5-s h A R轉(zhuǎn)錄活性較老年ARA55-sc下降（P＜0.05），而年輕人基質(zhì)細胞A R轉(zhuǎn)錄活性A R A 5 5-s c與ARA55-sh無差異（P＞0.05）（圖5A5A）。老年基質(zhì)細胞AR調(diào)控因子IGF-1、FGF2、KGF干擾后分泌下降（P＜0.05），而年輕組干擾前后分泌無差異（P＞0.05）（圖5B5B、圖5C5C、圖5D5D）。

以上結(jié)果證明老年基質(zhì)細胞高表達ARA55促進老年基質(zhì)細胞AR通路活性。

六、老年基質(zhì)細胞通過高表達ARA55ARA55促進前列腺前列腺上皮細胞增殖

基質(zhì)細胞干擾A R A 5 5后，基質(zhì)細胞與上皮細胞（BPH-1，LNCaP）共培養(yǎng)，老年基質(zhì)細胞ARA55-sh較ARA55-sc對前列腺上皮細胞的增殖促進作用減弱，第2天增殖出現(xiàn)差異（P＜0.05），而年輕ARA55-sh較ARA55-sc對上皮細胞增殖無明顯差異（P＞0.05）?；|(zhì)細胞對上皮細胞的增殖較BPH-1，LNCaP單獨培養(yǎng)增殖第2天出現(xiàn)差異有差異（P＜0.05）（圖6A6A、圖6B6B）。

老年基質(zhì)細胞高表達ARA55在促進上皮細胞（BPH-1，LNCaP）發(fā)揮著重要的作用。

圖5 干擾基質(zhì)細胞ARA55ARA55后，基質(zhì)細胞ARAR通路活性差異

圖6 干擾基質(zhì)細胞ARA55ARA55后，與上皮細胞共培養(yǎng)，上皮細胞增殖差異

討 論

前列腺是人體內(nèi)唯一一個具有階段性增長特征的器官[8]。不同年齡段前列腺生長速率不同，10～30歲和50～90歲為前列腺快速生長期[9]。前列腺癌也具有年齡相關(guān)性，多見于50歲以后的老年男性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，老年前列腺外周帶基質(zhì)細胞較年輕人能明顯促進前列腺上皮細胞的生長[7]。基質(zhì)細胞AR通過調(diào)控細胞因子分泌影響著前列腺微環(huán)境。AR在不同年齡段基質(zhì)細胞中的作用存在差異，我們通過干擾不同年齡段前列腺基質(zhì)細胞AR發(fā)現(xiàn)老年前列腺基質(zhì)細胞R對前列腺上皮細胞的增殖作用更強[6]。

在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，基質(zhì)上皮細胞之間的相互作用發(fā)揮著重要作用。而基質(zhì)細胞主要通過分泌一系列細胞因子對上皮細胞發(fā)揮作用。

awada等[10]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞分泌IGF-1可以促進前列腺癌的進展，小鼠前列腺基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基可以使IGF-IR磷酸化進而促進前列腺癌細胞系LNCaP和U-145的增殖。而前列腺癌中IGF-1和AR信號之間存在正反饋，在HepG2和LNCaP細胞系中，AR與配體結(jié)合后，AREs與IGF1上游啟動子結(jié)合，促進IGF1表達[11]。 FGF2可以通過旁分泌和自分泌的方式促進前列腺增生以及前列腺癌的發(fā)生和進展[12]?；|(zhì)細胞AR通過調(diào)節(jié)FGF2，KGF，F(xiàn)GF10，HGF等細胞因子的分泌，改變前列腺微環(huán)境，促進前列腺癌的發(fā)生[4]。通過染色體免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，前列腺基質(zhì)細胞系WPMY-1在雄激素刺激下，AR與ARA55共同結(jié)合GF的啟動子上，促進KGF分泌[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)前列腺基質(zhì)細胞在10nM DHT刺激下，老年基質(zhì)細胞較年輕人基質(zhì)細胞更明顯促進上皮細胞增殖，且老年基質(zhì)細胞AR的轉(zhuǎn)錄活性及AR調(diào)控相關(guān)細胞因子分泌較年輕人高。而我們前期研究通過干擾基質(zhì)細胞AR, 也證明了AR在不同年齡段基質(zhì)細胞對上皮細胞增殖促進作用不同，老年基質(zhì)細胞AR對上皮細胞促進增殖作用強于年輕人[6]。以上結(jié)果說明不同年齡基質(zhì)細胞AR通路活性不同，引起不同年齡段前列腺微環(huán)境差異，進而引起對前列腺上皮細胞促增殖差異。

AR共調(diào)節(jié)因子通過增強（共激活因子）或抑制（共抑制因子）AR轉(zhuǎn)錄活性影響DHT在特定組織中的作用[14]。AR的轉(zhuǎn)錄活性受ARA70, ARA54 和 ARA55等雄激素受體相關(guān)蛋白調(diào)控（ARA）。

RA55是一種基質(zhì)細胞特異性表達的AR共激活因子，ARA55通過調(diào)節(jié)基質(zhì)細胞AR轉(zhuǎn)錄促進前列腺癌上皮細胞生長。ARA55以配體結(jié)合的方式與AR結(jié)合，其可以增強AR的轉(zhuǎn)錄活性，改變配體特異性[15]。Fujimoto等[16]通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)高級別前列腺癌ARA55表達量高于低級別前列腺癌。而在雄激素難治性前列腺ARA55表達量低于未治療的前列腺癌患者[17]。有研究者通過比較鼠的永生化成纖維細胞系（BALB/3T3和NIH 3T3）與非永生化細胞，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，ARA55在永生化細胞系中表達量明顯低于非永生化細胞[18]。這提示我們ARA55作為一種重要的AR共激活因子可能在不同年齡段基質(zhì)細胞表達存在差異。

我們通過研究基質(zhì)細胞ARA55在不同年齡段基質(zhì)細胞表達發(fā)現(xiàn)：ARA55只表達于前列腺基質(zhì)細胞，老年人的基質(zhì)細胞ARA55表達高于年輕人。干擾基質(zhì)細胞ARA55后，給予生理濃度DHT刺激, 老年基質(zhì)細胞AR信號通路活性和AR調(diào)控因子分泌功能下降，對上皮細胞的促增殖作用下降。這說明老年基質(zhì)細胞高表達ARA55增強基質(zhì)細胞AR通路活性，改變前列腺微環(huán)境進而促進上皮細胞增殖。

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，不同年齡基質(zhì)細胞AR通路活性不同，老年基質(zhì)細胞AR通路活性高于年輕人，老年基質(zhì)細胞可能通過高表達共調(diào)節(jié)因子ARA55，促進AR轉(zhuǎn)錄活性及AR調(diào)控相關(guān)因子分泌促進前列腺上皮細胞增殖。這為我們研究老年高發(fā)前列腺癌提供了一個新的方向

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（2014-12-08收稿）

**通訊作者, E-mail: hanbm@163.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.001

中圖分類號R 737.25

*基金項目資助: 國家自然科學基金（NO.81072096）

Differential AR transcriptional activity in prostatic stromal cells from patients of varying ages and its implications in the proliferation of prostate epithelial cells*

Zou Qingsong, Liang Shengjie, GaoYuan, Mao Shikui, Hao Kuiyuan, Xia Shujie, Han Bangmin**
Department of Urology, Shanghai First People's Hospital Affi liated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China Corresponding author: Han Bangmin, E-mail: hanbm@163.com

AbstractObjective To investigate AR transcriptional activity in stromal cells in prostate PZ from patients of varying ages and its infl uence on the proliferation of BPH-1 and LNCaP. Methodsthods AR transcriptional activity in stromal cells treated with 10nmol DHT was identifi ed by AR dual-luciferase reporter assay and the levels of of the secreted FGF-2, KGF, IGF-1 were assessed by ELISA. The proliferation of BPH-1 and LNCaP cocultured with stromal cells was measured by Counting Kit-8. The expressions of ARA55 expression in stromal cells in prostate PZ from patients of varying ages were detected by HIC,Q-PCR, and Western blot. The expression of ARA55 in stromal cells was knocked down by lentivirus andtreated with 10nM DHT. Resultssults AR transcriptional activity and the level of the secreted AR-regulated cytokines in stromal cells treated with 10nM DHT from old patients were higher than those of young donors. The stromal cells from old patients could signifi cantly promote proliferation of BPH-1 and LNCaP. The ARA55 expression in prostate PZ from young donors and old patients were different and the expression of ARA55 was higher in old patients. The expression of AR showed no differencein in stroma cells with ARA55 inhibition in patients of varying ages. AR transcriptional activities and the levels of the secreted FGF-2, KGF, IGF-1 were lower in ARA55-sh than those in ARA55-sc in old patients (P＜0.05). The proliferation of BPH-1 and LNCaP decreased cocultured with stromal cells ARA55-sh as compared with ARA55-sc in old patients (P＜0.05) however, no obvious differences were shown in ARA55-sh and ARA55-sc in young donors (P＞0.05). Conclusionusion AR transcriptional activity and the secretion of AR-regulated cytokines were higher in stromal cells from old patients than those from young donors. The over expression of ARA55 in stromal cells from old patients could promote the proliferation of BPH-1 and LNCaP by increasing AR transcriptional activity and the secretion of AR-regulated cytokines.

Key wordsords prostatic neoplasms; stromal cells; cytokines