王家斌， 吳芳玲， 趙 琦

（福州大學生物和醫(yī)藥技術(shù)研究院，福建福州350002）

苯氧羧酸類除草劑是最早開發(fā)成功并廣泛用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的一類有機選擇性除草劑，其對植物有強烈的生理活性，具有高效、內(nèi)吸、高度選擇性等特點［1］。從化學結(jié)構(gòu)上看，苯氧羧酸類化合物容易成鹽，這使得其很容易溶解于地表水中，并迅速擴散，導致周圍環(huán)境的大面積污染進而嚴重威脅人類健康。雖然苯氧羧酸類除草劑本身只具有中等毒性，但其代謝產(chǎn)物（特別是一些鹵化物）對人類和生物體會造成嚴重危害［2］。研究表明，這些代謝產(chǎn)物可以引發(fā)人類軟組織惡性腫瘤，對動物體表現(xiàn)出胎盤毒性?，F(xiàn)今，全球苯氧羧酸類除草劑的生產(chǎn)和使用量仍居高不下，由于該類除草劑的潛在危害性，對它們在環(huán)境和作物中的殘留量檢測也越來越重要。國內(nèi)外對于苯氧羧酸類農(nóng)藥的殘留都制定了嚴格的殘留限量。我國2006年頒布的國家標準《生活飲用水衛(wèi)生標準》將2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）的限值規(guī)定為0.03 mg／L［3］；世界衛(wèi)生組織 2011 年頒布的《飲用水水質(zhì)指南》規(guī)定飲用水中2，4-D的限量指導值為 30 μg／L、2-（2，4-二氯苯氧基）丙酸（2，4-DP）的限量指導值為 100 μg／L［4］。

目前，苯氧羧酸類除草劑的殘留檢測方法有氣相色譜-電子俘獲檢測法（GC-ECD）［5］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法（GC-MS）［6］、高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）［7］、高效液相色譜-二極管陣列檢測 法［8］、液 相 色 譜-質(zhì) 譜 聯(lián) 用 檢 測 法 （LCMS）［9-11］、電泳檢測法（CE）［12，13］以及酶聯(lián)免疫檢測法（ELISA）［14］等。其中，氣相色譜法和高效液相色譜法是最為通用，同時也是許多標準中使用的檢測方法。對比氣相色譜法，高效液相色譜法由于無需對樣品進行衍生，簡化了操作步驟，減少了干擾，因此更適用于苯氧羧酸類除草劑的檢測。

此外，由于實際樣品成分復(fù)雜，多含有易損害色譜柱的大分子物質(zhì)；而且對于可疑樣品，特別是含量較低的樣品，需要結(jié)合前處理富集技術(shù)，提高檢測靈敏度。管內(nèi)固相微萃?。╥n-tube SPME）技術(shù)是一種少溶劑的固相微萃取技術(shù)，具有操作簡單、耗時少、效率高、易于自動化和與其他技術(shù)在線聯(lián)用等優(yōu)點［15］。固相微萃取與高效液相色譜在線聯(lián)用，不僅可以簡化樣品前處理步驟，而且可以實現(xiàn)分析的自動化，提高分析的靈敏度［16］。

由于聚合物整體柱具有原位制備、通透性好，傳質(zhì)阻力低、表面易于改性等優(yōu)點［17-19］，近年來在固相（微）萃取介質(zhì)［17，20-22］、色譜分離介質(zhì)（色譜整體柱）［23-25］等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。羅偉強等［20］在不銹鋼管內(nèi)制備聚（甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙二醇酯）整體柱作為萃取柱，并用于水果中氯吡脲的分析測定；Wang等［21］以摻雜單壁碳納米管的聚（甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙二醇酯）整體柱為管內(nèi)固相微萃取整體柱，采用管內(nèi)固相微萃取-實時直接分析質(zhì)譜法聯(lián)用在線富集檢測樣品中的6種三嗪類除草劑。

本論文以自制C18毛細管整體柱作為固相微萃取柱，構(gòu)建在線固相微萃取-高效液相色譜（intube SPME-HPLC）聯(lián)用系統(tǒng)，同步富集檢測5種苯氧羧酸類除草劑（即2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），苯氧丙酸（PPA），2-（2-氯）-苯氧丙酸（2，2-CPPA），2-（3-氯）-苯氧丙酸（2，3-CPPA），2-（2，4-二氯苯氧基）丙酸（2，4-DP）），考察了 in-tube SPME-HPLC聯(lián)用系統(tǒng)主要運行參數(shù)對5種苯氧羧酸類除草劑富集檢測的影響，并利用聯(lián)用系統(tǒng)檢測了環(huán)境水樣中的5種苯氧羧酸類除草劑。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

EasySep-LC1010液相色譜儀（美國Unimicro Technologies公司）；LC-10AD液相色譜泵（日本島津公司）；XL30ESEM電子掃描顯微鏡（荷蘭FEI公司）；GL-16C離心機（最高轉(zhuǎn)速16 000 r／min）（上海安亭科技儀器廠）；601超級恒溫水浴（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；Milli-Q Reference型超純水系統(tǒng)（美國 Millipore公司）。液相色譜分析柱Gemini 5u C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）（美國Phenomenex公司）。

甲基丙烯酸十八烷基酯（SMA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）、γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）（美國 ACROS 公司）；環(huán)己醇、1，4-丁二醇（分析純，天津市光復(fù)精細化工研究所）；偶氮二異丁腈（AIBN，化學純，上海試劑四廠）；乙腈（ACN）、甲醇（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；鹽酸、氫氧化鈉和三氟乙酸（TFA）（分析純，上海試劑總廠）。所用水均為超純水，由Milli-Q reference型超純水系統(tǒng)制得。熔融石英毛細管（250 μm i.d.，375 μm o.d.，河北永年銳灃色譜器件有限公司）。純氮氣（N2，福州開發(fā)區(qū)友輝氣體有限公司）。除草劑標準品：2，4-D、PPA、2，2-CPPA、2，3-CPPA、2，4-DP購自美國SIGMA公司。檢測水樣取自福州市閩侯縣上街鎮(zhèn)厚美村和浦口村。

1.2 溶液配制

0.1%TFA溶液：取1 mL TFA溶于超純水，并移入1 000 mL容量瓶中，用超純水定容，即得0.1%的TFA溶液。使用前需要用水系濾膜過濾，再超聲脫氣30 min。苯氧羧酸類標準儲備液：分別稱取適量的 2，4-D、PPA、2，2-CPPA、2，3-CPPA 和 2，4-DP溶解于乙腈中，配制成100 mg／L的標準儲備液。實驗前用流動相配制成所需濃度的標準溶液。

1.3 樣品處理

取10 mL（精確到0.01 mL）的檢測水樣，先用0.01 mL的TFA進行酸化處理，在轉(zhuǎn)速為5 000 r／min 下離心5 min，取上清液用 0.22 μm 水系濾膜過濾，用于in-tube SPME-HPLC聯(lián)用系統(tǒng)測定。

1.4 固相微萃取整體柱的制備

在制備固相微萃取整體柱時，為保證毛細管整體柱內(nèi)連續(xù)床層固定相穩(wěn)定、不移動，首先對毛細管內(nèi)壁進行預(yù)烯基化處理，在毛細管內(nèi)壁鍵合上一層帶烯基官能團的硅烷化試劑［26］。整體柱制備方法參考文獻［27］。整體柱反應(yīng)液由功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑組成，其中：SMA（18.0%，質(zhì)量分數(shù)）作為功能單體；EDMA（12.0%，質(zhì)量分數(shù)）作為交聯(lián)劑；環(huán)己醇（56.0%，質(zhì)量分數(shù)）和 1，4-丁二醇（14.0%，質(zhì)量分數(shù)）為致孔劑；AIBN（按單體質(zhì)量的0.3%加入）作為引發(fā)劑［18］。反應(yīng)液用漩渦混合器混勻，超聲15～20 min，用0.22 μm 有機系微孔濾膜過濾。之后用微孔注射器將處理好的反應(yīng)液勻速注滿已經(jīng)預(yù)處理過的毛細管空管，用氣相色譜進樣橡膠墊片將毛細管兩端封口，放入60℃水浴鍋中恒溫加熱24 h。24 h之后取出毛細管，除去兩端的橡膠墊片，以甲醇為流動相，在液相色譜泵上沖洗毛細管色譜柱約1 h，除去床層內(nèi)殘留的致孔劑、未反應(yīng)的單體以及反應(yīng)生成的一些副產(chǎn)物，得到毛細管整體柱。截取20 cm毛細管整體柱，作為在線固相微萃取毛細管整體柱，待用。

1.5 固相微萃取整體柱截面形貌觀察

從毛細管的填料端切下長約為2 cm的一段，用XL30ESEM電子掃描顯微鏡觀察固相微萃取毛細管整體柱的截面形貌。

1.6 in－tube SPME－HPLC 系統(tǒng)的構(gòu)建與運行

in-tube SPME-HPLC 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)參考文獻［28］構(gòu)建，采用雙泵雙六通閥系統(tǒng)，如圖1所示：六通閥V1定量環(huán)位置（即1、4號位）為500 μL的定量PEEK管（聚醚醚酮管），六通閥V2的定量環(huán)位置（即1、4號位）為制備的毛細管整體柱；泵A與六通閥V1的6號位連接，泵B與六通閥V2的6號位連接，六通閥V1的5號位與六通閥V2的2號位相連。

聯(lián)用系統(tǒng)運行流程：（1）實驗開始時，六通閥V1處于Load狀態(tài)，此時樣品直接進入定量PEEK管。樣品裝載液（0.1%TFA 溶液-乙腈（98∶2，v／v））通過泵A，經(jīng)過六通閥V1，平衡固相微萃取整體柱。六通閥V2處于Load狀態(tài)，流動相通過泵B，以1.0 mL／min流速直接平衡液相色譜分析柱，以獲得一個穩(wěn)定的色譜分離基線。（2）進樣完成后，開始富集清洗，六通閥V1由Load狀態(tài)調(diào)為Inject狀態(tài)，泵A與500 μL的定量PEEK管相通，泵A以0.04 mL／min流速將樣品帶入六通閥V2的固相微萃取整體柱。進樣13 min后，六通閥V1重新調(diào)到Load狀態(tài)，以樣品裝載液沖洗固相微萃取柱90 s，目的是消除固相微萃取柱中的水溶性雜質(zhì)。（3）完成富集清洗后，將泵B的流速調(diào)為0.02 mL／min，六通閥V2由Load狀態(tài)調(diào)為Inject狀態(tài)后，用流動相以0.02 mL／min洗脫固相微萃取柱5 min，目的是將固相微萃取柱上富集的樣品洗脫至分離柱中。洗脫結(jié)束后，將六通閥V2的狀態(tài)重新調(diào)到Load狀態(tài)，同時將泵B流速調(diào)為1.0 mL／min開始液相色譜分離檢測。

圖1 in－tube SPME－HPLC聯(lián)用系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Construction of in－tube SPME－HPLC

2 結(jié)果與討論

2.1 固相微萃取整體柱的表征

2.1.1 固相微萃取整體柱截面形貌觀察

圖2是按1.4節(jié)的制備方法制得的固相微萃取整體柱截面的電鏡圖。由圖2可以清楚地看出這種整體柱內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻且連續(xù)，具有相互貫穿的通孔結(jié)構(gòu)，通透孔較大，大的通孔提供了較好的滲透性，有利于流動相的流動。此外，整體柱柱床和毛細管管壁結(jié)合緊密，沒有產(chǎn)生裂縫。這說明整體柱與毛細管內(nèi)壁鍵合良好。

2.1.2 固相微萃取整體柱的滲透性考察

本實驗中，以甲醇為流動相，考察了在不同流速下固相微萃取整體柱的柱壓降，以此表征整體柱的滲透性。當流動相（甲醇）流速從0.02 mL／min增加到0.06 mL／min時，整體柱的柱壓降也相應(yīng)從1.2 MPa線性提高到7.0 MPa，說明固相微萃取整體柱的滲透性良好。

圖2 固相微萃取整體柱截面的電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope（SEM）photographs of the cross section of the SPME monolithic column

2.2 分離條件的選擇

文獻報道的測定苯氧羧酸類化合物的HPLC流動相體系主要有：乙腈-水體系［7］、乙腈-三乙胺水溶液（pH=10）體系［8］、甲醇-乙酸銨溶液體系［29］等。通過反復(fù)對比試驗，本實驗選擇的流動相體系為0.1% （v／v）TFA 水溶液-乙腈（55∶45，v／v），其他條件為流動相流速1.0 mL／min，柱溫30℃，檢測波長為214 nm。在該條件下，5種苯氧羧酸類除草劑的分離效果較好，15 min內(nèi)可完全分離。

2.3 in－tube SPME－HPLC 聯(lián)用系統(tǒng)運行條件優(yōu)化

固相微萃取毛細管整體柱長度、進樣流速、進樣時間、洗脫流速、洗脫時間等運行條件對in-tube SPME-HPLC聯(lián)用系統(tǒng)檢測都有影響，為了得到intube SPME-HPLC聯(lián)用系統(tǒng)的最佳運行條件，我們對以上幾個系統(tǒng)運行參數(shù)進行了考察。

2.3.1 固相微萃取毛細管整體柱長度的影響

在in-tube SPME-HPLC聯(lián)用系統(tǒng)中，毛細管整體柱作為固相微萃取的介質(zhì)，是整個聯(lián)用系統(tǒng)的重要組成部分。固相微萃取介質(zhì)量的多少直接影響到in-tube SPME-HPLC聯(lián)用系統(tǒng)的萃取能力。實驗中，以250 μm內(nèi)徑的毛細管制作固相微萃取整體柱，使用的整體柱越長則固相微萃取介質(zhì)的量就越大，萃取能力就越強。由圖3可以看出，保持其他條件不變，隨著固相微萃取整體柱長度的增加，5種除草劑的峰面積不斷增大。當整體柱長度大于20 cm以后，峰面積沒有明顯增大，考慮到隨著使用的整體柱長度的增加，系統(tǒng)的柱壓也不斷增大，導致系統(tǒng)穩(wěn)定性下降。因此，選用固相微萃取毛細管整體柱長度為20 cm。

圖3 固相微萃取整體柱長度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of the length of the SPME monolithic column

2.3.2 進樣流速的影響

在進樣量不變的情況下，進樣流速越大，則全部進樣的時間越短。在保持進樣量500 μL不變的前提下，考察了進樣流速對5種除草劑峰面積的影響。由圖4可知，進樣流速越大，5種除草劑的峰面積越小。這是因為進樣流速越大，樣品在整體柱上的作用時間越短，保留下降。當流速大于0.04 mL／min時，5種除草劑的峰面積明顯減小。當進樣流速在0.02～0.04 mL／min時，5種除草劑的峰面積變化不大，但由于低的流速造成進樣時間過長，導致實驗效率不高。因此，選用 0.04 mL／min作為進樣流速。

2.3.3 進樣時間的影響

在保持進樣流速不變的前提下，實驗考察了進樣時間對5種除草劑的峰面積的影響。由圖5可知，進樣時間越長，5種除草劑的峰面積越大。這是因為進樣時間越長，樣品的進樣量越多，當進樣時間小于13 min時5種苯氧羧酸類除草劑的峰面積隨進樣時間的增長而增大且變化趨勢較大，但在進樣時間大于13 min后5種苯氧羧酸類除草劑的峰面積隨時間的變化不明顯。說明樣品在進樣13 min后已接近完全進樣。因此，選用13 min作為進樣時間。

圖4 進樣流速的優(yōu)化Fig.4 Optimization of sampling flow rate

圖5 進樣時間的優(yōu)化Fig.5 Optimization of sampling time

2.3.4 洗脫流速的影響

為減少固相微萃取整體柱上所吸附雜質(zhì)的洗脫并使聯(lián)用系統(tǒng)更加穩(wěn)定，本實驗中以流動相作為洗脫液，洗脫富集在固相微萃取整體柱上的樣品。在固定其他條件不變的情況下，考察了洗脫流速對5種除草劑的峰面積的影響。由圖6可知：當流速小于0.02 mL／min時，5種分析物質(zhì)的峰面積隨流速增大逐漸增大，這是由于洗脫液體積增加使得分析對象洗脫得更充分；當流速大于0.02 mL／min時，5種分析物質(zhì)的峰面積隨流速增大有所下降，這可能是由于高的流速減少了洗脫液在固相微萃取整體柱上的作用時間，反而降低了洗脫能力。因此，選用的洗脫流速為0.02 mL／min。

圖6 洗脫流速的優(yōu)化Fig.6 Optimization of elution flow rate

2.3.5 洗脫時間的影響

在固定其他條件不變的情況下，考察了洗脫時間對這5種除草劑峰面積的影響。由圖7可知，在洗脫時間小于5 min時，5種除草劑的峰面積隨洗脫時間的增長而增大；當洗脫時間大于5 min以后，5種除草劑的峰面積沒有明顯變化。這表明當洗脫時間為5 min時，樣品已接近完全洗脫。因此，選用的洗脫時間為5 min。

通過以上考察，我們得到了 in-tube SPMEHPLC聯(lián)用系統(tǒng)最優(yōu)運行條件：在線固相微萃取毛細管整體柱長度為20 cm，進樣流速為0.04 mL／min，進樣時間為 13 min，洗脫流速為 0.02mL／min，洗脫時間為5 min。

圖7 洗脫時間的優(yōu)化Fig.7 Optimization of elution time

2.4 方法驗證

利用in-tube SPME-HPLC聯(lián)用系統(tǒng)，我們對水樣中添加的5種苯氧羧酸類除草劑進行了同步富集檢測，對聯(lián)用系統(tǒng)檢測與直接進樣檢測進行了比較、并考察了5種苯氧羧酸類除草劑in-tube SPMEHPLC聯(lián)用檢測方法的工作曲線、檢出限、回收率和重現(xiàn)性。

2.4.1 聯(lián)用系統(tǒng)檢測與直接進樣檢測比較

在處理后的水樣中添加相同濃度的標準品后，我們進行了聯(lián)用系統(tǒng)檢測與直接進樣檢測的分離情況對比的實驗。從圖8可以清晰地看出，直接進樣檢測時，樣品溶劑峰干擾大，樣品區(qū)帶展寬明顯，造成分離對象峰形拖尾不對稱，峰高下降，部分檢測對象分離度無法滿足檢測要求；采用in-tube SPMEHPLC聯(lián)用系統(tǒng)檢測時，溶劑峰顯著下降，各分析對象峰形對稱，分離度較好，可以滿足分離檢測要求。通過計算兩種情況下檢測對象的峰面積比值，5種苯氧羧酸類除草劑的富集倍數(shù)分別為：3倍（PPA）、27 倍（2，2-CPPA）、27 倍（2，3-CPPA）、21 倍（2，4-D）和21倍（2，4-DP）。這說明相比直接進樣，聯(lián)用檢測系統(tǒng)的檢測靈敏度顯著提高。

2.4.2 工作曲線與檢出限

在最佳聯(lián)用系統(tǒng)運行以及分離條件下，取不同濃度的空白加標水樣進行工作曲線回歸參數(shù)及檢出限的測定。結(jié)果如表1所示：5種苯氧羧酸類除草劑在各自的線性范圍內(nèi)具有較好的線性相關(guān)性（R2＞0.99）；以信噪比為3時對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限，5種苯氧羧酸類除草劑的檢出限均在10 μg／L以下，符合國內(nèi)外相關(guān)標準［3，4］的檢測要求。

圖8 （a）直接進樣檢測與（b）聯(lián)用系統(tǒng)檢測的分離色譜圖Fig.8 Chromatograms of（a）direct injection HPLC and （b）in－tube SPME－HPLC

表1 5種苯氧羧酸類除草劑的基質(zhì)工作曲線與檢出限Table 1 Matrix calibration curves and LODs of the five phenoxy acid herbicides

2.4.3 回收率

在聯(lián)用系統(tǒng)最優(yōu)條件下，通過向空白水樣中準確加入不同濃度的5種苯氧羧酸類除草劑標準溶液，之后對樣品進行前處理，并利用聯(lián)用系統(tǒng)進行檢測，以表征方法的回收率（n=5）。表2給出了各加標濃度的回收率結(jié)果：5種苯氧羧酸類除草劑的回收率在79.0%～98.0%之間，而相對標準偏差（RSD）≤3.9%。本方法成功應(yīng)用于這5種苯氧羧酸類除草劑的同步富集檢測，獲得較為滿意的結(jié)果。

2.4.4 重現(xiàn)性

在最佳分離條件下，以實際樣品中的2，4-D的保留時間和峰面積的相對標準偏差（RSD）為例檢驗方法的重現(xiàn)性。2，4-D的日內(nèi)保留時間和峰面積的相對標準偏差分別為0.56%和1.83%，日間保留時間和峰面積的相對標準偏差分別為0.93%和3.91%。這表明in-tube SPME-HPLC聯(lián)用系統(tǒng)檢測的重現(xiàn)性良好。

表2 空白水樣品中5種苯氧羧酸類除草劑的回收率（n＝5）Table 2 Recoveries of the five phenoxy acid herbicides spiked in a blank water sample（n＝5）

2.5 實際樣品測定

對取自兩個地區(qū)的水樣進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了2，4-D，未發(fā)現(xiàn)其他4種除草劑殘留；2，4-D的殘留量分別為 16.3 μg／L （厚美村）和 22.3 μg／L（浦口村）。

3 結(jié)論

以采用甲基丙烯酸十八烷基酯為功能單體制備的毛細管整體柱作為在線固相微萃取柱，構(gòu)建在線管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用系統(tǒng)，同步富集檢測環(huán)境水樣中的5種苯氧羧酸類除草劑（即2，4-二氯苯氧乙酸、苯氧丙酸、2-（2-氯）-苯氧丙酸、2-（3-氯）-苯氧丙酸、2-（2，4-二氯苯氧基）丙酸）。與HPLC系統(tǒng)直接進樣對比，聯(lián)用系統(tǒng)對5種苯氧羧酸類除草劑表現(xiàn)出優(yōu)良的富集能力。該方法成功應(yīng)用于水樣中5種苯氧羧酸類除草劑的同步富集檢測，獲得了滿意的結(jié)果，為相關(guān)農(nóng)藥的分析檢測技術(shù)研究提供了科學參考和可行的實驗思路。

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