孟憲雙， 馬 強， 白 樺， 張 慶， 呂 慶

（中國檢驗檢疫科學研究院，北京100176）

自20世紀50年代國際上開始廣泛使用防曬化妝品以來，防曬已成為當今化妝品領(lǐng)域的熱門話題之一。防曬劑按其防曬機理的不同，大體分為紫外線吸收劑和紫外線散射劑（物理阻擋劑）［1］，前者如水楊酸類、對氨基苯甲酸類、香豆素類等物質(zhì)，這些物質(zhì)的分子能夠吸收紫外線的能量，然后再以熱能或無害的可見光效應(yīng)釋放出來，從而保證皮膚免受紫外線的傷害；后者主要包括氧化鋅、二氧化鈦、氧化亞鐵等物質(zhì)，主要通過散射作用以減少紫外線與皮膚的接觸來防止紫外線對皮膚的侵害，其防曬效果不如前者明顯，價格較高；加之前者更易用于配方，所以市售防曬劑80%為紫外線吸收劑［2-4］。近年來，防曬化妝品的需求逐年增加，與之相對應(yīng)的安全性問題也越來越受廣大消費者的關(guān)注。紫外線吸收劑為化學合成物質(zhì)，在紫外線作用下會分解和裂變［5，6］，降解后的小分子容易被皮膚吸收［4］，存在誘發(fā)丘疹和膿皰，甚至光毒性和皮膚過敏等風險［7］。目前歐盟及各國對紫外線吸收劑的使用分別作了限量要求［2］，我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007 年版）（以下簡稱《規(guī)范》）［8］對 28種防曬劑（26種紫外線吸收劑和2種紫外線散射劑）的限量做了明確規(guī)定。因此，建立防曬化妝品中紫外線吸收劑的高效、準確、靈敏的檢測方法，對加強產(chǎn)品的質(zhì)量安全監(jiān)管具有重要意義。

據(jù)國內(nèi)外文獻報道，國外研究者近年來的研究對象主要集中在植物［9］、魚類組織［10］、水樣［11，12］等中的紫外線吸收劑，采用的檢測手段為液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)；近幾年國內(nèi)學者對化妝品中紫外線吸收劑的檢測方法開展了相關(guān)研究，檢測方法絕大多數(shù)為 HPLC 法［1，2，13-18］。本研究在系統(tǒng)總結(jié)同行學者的相關(guān)工作后，注意到在紫外線吸收劑的選擇方面，《規(guī)范》及國內(nèi)報道［1，2，13-16］中的研究對象主要集中在甲氧基肉桂酸異戊酯、胡莫柳酯、水楊酸乙基己酯、丁基甲氧基二苯甲?；淄?、苯基苯并咪唑磺酸、4-甲基芐亞基樟腦及二苯酮-3，其使用頻度也較高［19］，且《規(guī)范》也對其在化妝品中使用的限量值做了規(guī)定（見表1），少數(shù)文獻也研究了二乙氨基羥苯甲?；郊姿峒乎ゼ岸郊淄?，13，15，20］。二苯酮類化合物屬于市售化妝品中易添加的紫外線吸收劑品種［16］，雖然《規(guī)范》只針對其中的二苯酮-3、二苯酮-4和二苯酮-5的限量值進行了規(guī)定，但鑒于二苯酮屬于一大類化合物，其化學性質(zhì)相近，且均可作為紫外線吸收劑或者紫外線吸收劑輔助制劑，因此，本文在選取上述9種常見紫外線吸收劑外，同時將二苯酮-1、二苯酮-2、二苯酮-6、二苯酮-8、二苯酮-10及二苯酮-12作為研究對象，總共囊括了對氨基苯甲酸（p-aminobenzoic acid，PABA）及其衍生物、水楊酸酯（salicylates）及其衍生物、肉桂酸酯類（cinnamates）、二苯甲酮類化合物 （benzophenones）、鄰氨基苯甲酸酯（anthranilate）及其衍生物、樟腦類衍生物（camphor derivatives）及二苯甲酰甲烷類（dibenzoyl methanes）在內(nèi)的15種紫外線吸收劑。針對《規(guī)范》及文獻中采用的樣品處理及檢測方法，歸納起來主要存在以下幾個問題：a.在前處理過程中使用的四氫呋喃和高氯酸，在上機測定前并未除去，容易對儀器管路聚醚醚酮（PEEK）材料和色譜柱造成腐蝕；b.單以甲醇作為提取溶劑不適合所有基質(zhì)類型，尤其對某些唇膏等蠟質(zhì)樣品并不能使其完全分散，從而造成回收率偏低，因此方法的普適性不高；c.流動相采用高濃度的異丙醇極易造成柱壓上升，使系統(tǒng)難以平衡，造成基線漂移；d.采用高氯酸作為酸性改性劑，引起強氧化性，會縮短色譜柱的使用壽命，腐蝕儀器的管路等部件。因此，本文選取最大范圍的基質(zhì)類型（包括化妝水、乳液、膏霜及唇膏等）進行研究，對上述文獻中普適性較窄的提取溶劑進行改進；對前處理過程中采用的合適的提取溶劑進行濃度及用量上的優(yōu)化；對分析前不適宜的樣品溶劑進行有效處理，選擇合適的上機溶劑且不降低物質(zhì)的響應(yīng)強度；對分析過程中采用的流動相種類及改性劑進行優(yōu)化，盡量使色譜儀在采樣過程中的基線保持平穩(wěn)，把儀器對定量結(jié)果準確性的影響降至最低程度。本文在系統(tǒng)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用常規(guī)的C18色譜柱，實現(xiàn)了15種紫外線吸收劑的全部基線分離，方法定量準確，便于推廣普及，為防曬類化妝品的質(zhì)量安全監(jiān)管提供了實用有效的檢測方法。

表1 15種紫外線吸收劑的相關(guān)信息及在化妝品中的最大允許使用量［8］Table 1 Information and the maximum permissible contents of the 15 UV filters in cosmetics［8］

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1200高效液相色譜儀，配在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；甲醇和四氫呋喃（色譜純，美國Fisher公司）；飽和氫氧化銨溶液（分析純，北京化工廠）。

p-甲氧基肉桂酸異戊酯、4-甲基芐亞基樟腦、二苯酮-2、二苯酮-3、二苯酮-10、二苯酮-8、二苯酮-6、二苯酮-12及二苯酮-1均購自百靈威科技有限公司；胡莫柳酯、水楊酸乙基己酯、丁基甲氧基二苯甲?；淄?、二乙氨基羥苯甲?；郊姿峒乎ァ⒈交讲⑦溥蚧撬峒岸郊淄徸許igma-Aldrich公司；標準品的純度均大于92%。

樣品：市售的33份化妝品，其中包括化妝水9份、乳液7份、膏霜12份和唇膏5份。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取各紫外線吸收劑標準品50 mg（精確至0.1 mg）于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得1 g／L的標準儲備液，保存于4℃條件下；分別準確量取1 mL各標準儲備液至20 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成50 mg／L的混合標準儲備液，再用甲醇逐級稀釋成20、10、5、2、1、0.5、0.2 mg／L 的混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

對于除唇膏外易于分散的試樣：稱取0.5 g（精確至0.001 g）試樣于25 mL具塞比色管中，向比色管中加入4 mL四氫呋喃（含2 g／L氫氧化銨），渦旋振蕩混勻，再加入80%（v／v）甲醇水溶液定容至10 mL，渦旋混勻，然后超聲提取10 min。取部分提取溶液轉(zhuǎn)移至10 mL具塞塑料離心管中，以10 000 r／min離心10 min，取2 mL上清液經(jīng)氮吹儀吹掃近干后，用2 mL甲醇重新溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后進行測定。

對于唇膏等不易分散的蠟質(zhì)試樣：加入4 mL四氫呋喃（含2 g／L氫氧化銨），渦旋振蕩，如仍不能使試樣完全分散，可采用超聲振蕩加熱（50℃）的方式使試樣分散完全，然后向比色管中加入80%（v／v）甲醇水溶液，定容至10 mL，后續(xù)步驟與其他樣品相同。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Waters XTerra MS C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：A 相為水（含 0.1% （v／v）甲酸），B 相為甲醇（含 0.1% （v／v）甲酸）；流速：1 mL／min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；梯度洗脫程序：0～5 min，55%A ～25%A；5 ～8 min，25%A ～22%A；8 ～10 min，22%A；10 ～20 min，22%A ～10%A；20 ～21 min，10%A ～5%A；21 ～23 min，5%A；23 ～24 min，5%A ～55%A；24 ～28 min，55%A。檢測波長：280 nm和311 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

化妝水、乳液、膏霜及唇膏類化妝品的組成成分千差萬別。鑒于化妝品不同類型樣品在前處理過程中的分散難易程度不同，并參考相關(guān)文獻［1，2］，本實驗采用不同體積分數(shù)（50%、60%、70%、80%、90%）的甲醇水溶液對空白加標試樣中的目標物質(zhì)進行提取。結(jié)果表明，除唇膏等蠟質(zhì)試樣外，其他基質(zhì)類型樣品在高甲醇含量的水溶液提取條件下，仍有部分目標物質(zhì)的提取效率不高，而且唇膏等蠟基質(zhì)試樣用甲醇也無法分散完全，從而導致目標物質(zhì)回收率較低。針對該問題，本實驗在試樣中首先加入四氫呋喃分散樣品，然后加入80%（v／v）甲醇水溶液進行提取的方法進行樣品中目標物質(zhì)的提取。實驗結(jié)果顯示，除唇膏類樣品外，其他基質(zhì)類型化妝品試樣在4 mL四氫呋喃及6 mL 80%（v／v）甲醇水溶液提取條件下所有目標物質(zhì)均有較高的回收率。而對于某些唇膏等蠟基質(zhì)類型樣品，加入四氫呋喃后仍不能使其分散完全，因此本實驗采用振蕩加熱至50℃的方式使唇膏等基質(zhì)分散完全，結(jié)果顯示，此條件下試樣分散效果較好，目標物質(zhì)的回收率達到滿意的效果。

當降低空白加標水平至0.1%（質(zhì)量分數(shù)）以下時，除2-苯基苯并咪唑-5-磺酸回收率較低外，其他目標物質(zhì)的回收率均達到80%以上。根據(jù)2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的化學結(jié)構(gòu)式，其帶有磺酸基，在中性條件下為解離狀態(tài)，離子狀態(tài)使得其增加了在水相中的溶解度，從而導致其回收率偏低。因此，在提取溶劑中加入流動相中常添加的酸性改性劑甲酸來抑制2-苯基苯并咪唑-5-磺酸中磺酸基團的解離。實驗結(jié)果顯示，在該物質(zhì)含量較低時，可以顯著提高目標物質(zhì)回收率；但在高濃度時，回收率仍偏低?？紤]到該物質(zhì)在氨化甲醇中有良好的溶解度，因此本實驗又考察了在四氫呋喃中添加不同濃度的氫氧化銨條件下各物質(zhì)的回收率效果。實驗結(jié)果表明，添加2 g／L氫氧化銨可使得2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的回收率明顯提高，而且其他物質(zhì)的回收率均不受影響。因此，最終確定采用4 mL含2 g／L氫氧化銨的四氫呋喃溶液預處理試樣，然后加入6 mL 80%甲醇水溶液進行提取的前處理條件。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

色譜柱的種類對分析結(jié)果有至關(guān)重要的影響，C18柱和苯基柱是實驗室常用的反相色譜柱。因采用不同的鍵合技術(shù)和硅羥基封端基團的不同，雖同為C18填料，但其選擇性存在區(qū)別。本實驗中選擇了 Waters XTerra C18、Agilent Zorbax SB-Phenyl、大連依利特公司的 Kromasil C18、Agilent Zorbax SB C184種不同品牌、選擇分離性存在差異的色譜柱（規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）分別進行梯度洗脫條件優(yōu)化。結(jié)果表明，二苯酮-1、二苯酮-8和二苯甲酮在Agilent Zorbax SB-Phenyl和 Kromasil C18色譜柱上難以分離；而Agilent Zorbax SB C18對水楊酸乙基己酯和胡莫柳酯的色譜分離存在難度；在Waters XTerra C18柱上經(jīng)梯度洗脫條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了15種紫外線吸收劑的全部基線分離。

2.2.2 流動相的選擇

文獻［13，15］分別選擇了高濃度的異丙醇和四氫呋喃作為流動相，實驗發(fā)現(xiàn)，異丙醇由于黏度較高，容易引起色譜系統(tǒng)的壓力上升，造成基線不穩(wěn)；而四氫呋喃作為一種常見的環(huán)醚，易被氧化，對PEEK管路造成損壞，且毒性較強。因此，本研究考慮采用常規(guī)的甲醇或乙腈和水添加一定濃度的酸性改性劑作為流動相，以期實現(xiàn)15種目標物質(zhì)的分離。采用乙腈和水為流動相進行洗脫時，由于乙腈的洗脫能力較強，實現(xiàn)基線分離較為困難；以甲醇和水為流動相進行洗脫時，洗脫效果明顯好轉(zhuǎn)，通過梯度條件的優(yōu)化，基本實現(xiàn)全部目標物的分離，但2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的色譜峰拖尾嚴重。

為了改善目標物的色譜峰形，在流動相中分別添加0.1%甲酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的色譜峰形明顯較未添加酸性改性劑時對稱，且明顯改善了各物質(zhì)間的分離度。15種紫外線吸收劑的色譜分離譜圖見圖1。

圖1 280 nm和311 nm檢測波長下15種紫外線吸收劑的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the 15 UV filters at two detection wavelengths of 280 nm and 311 nm

2.2.3 檢測波長的選擇

通過二極管陣列檢測器對15種目標化合物在200～400 nm范圍掃描，發(fā)現(xiàn)除二苯甲酮在280 nm波長附近存在最大紫外吸收外，其他所有化合物均在311 nm波長附近有最大紫外吸收，因此，確定同時采集280 nm和311 nm波長下的色譜分離圖譜，除二苯甲酮采用280 nm波長下的紫外吸收值定量外，其他化合物均采用311 nm波長下各自的紫外吸收值進行定量計算。

2.3 方法的線性關(guān)系及定量限

在1.4節(jié)的最佳分析條件下，分別對系列質(zhì)量濃度的混合標準工作溶液進行測定，以各化合物的質(zhì)量濃度X（mg／L）為橫坐標、色譜峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，建立標準工作曲線。結(jié)果表明，15種紫外線吸收劑在0.5～50 mg／L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r2≥0.999 1）（見表2）。

在不含目標物質(zhì)的空白化妝品基質(zhì)中添加不同濃度的目標化合物標準溶液，按照建立的實驗方法進行預處理和分析測定，以10倍信噪比（S／N=10）對應(yīng)的化合物濃度作為目標物質(zhì)的方法定量限，結(jié)果見表2。

2.4 回收率及精密度

在經(jīng)測定不含15種紫外線吸收劑的空白樣品中添加低、中、高3個水平的目標物標準溶液，按照1.3節(jié)和1.4節(jié)下的條件進行樣品處理和分析測定，用標準工作曲線定量，計算方法的回收率。15種紫外線吸收劑在低、中、高3個添加水平下的平均回收率為84.2%～100.7%，相對標準偏差（RSD）為0.9%～9.5%（見表3）。由此可見，該方法具有良好的準確性和精密度。

表2 15種紫外線吸收劑的保留時間、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限Table 2 Retention times （tR），linear equations，correlation coefficients （r2）and LOQs of the 15 UV filters

表3 不同類型化妝品中15種紫外線吸收劑的加標回收率和精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and precisions（RSDs）of the 15 UV filters spiked in blank cosmetics（n ＝6）

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

2.5 實際樣品的檢測

按照本實驗建立的方法對市售的33份化妝品進行紫外線吸收劑的測定，從1份化妝水和1份乳液樣品中檢出p-甲氧基肉桂酸異戊酯（含量分別為6.7%和8.1%），1份唇膏樣品中檢出4-甲基芐亞基樟腦（含量3.7%），其含量值均在我國規(guī)定［8］的限量范圍內(nèi)，其他樣品均未檢出。檢出的陽性樣品同時采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行了確證，結(jié)果顯示被檢出樣品無假陽性；對陰性樣品進行LC-MS／MS分析，無目標成分被檢出。

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)總結(jié)了近幾年學者關(guān)于紫外線吸收劑檢測方法的研究工作，主要針對其方法對樣品的普適性、樣品前處理技術(shù)中的樣品分散溶劑、萃取溶劑和萃取時間、LC分析中流動相種類等主要參數(shù)進行了改進和優(yōu)化，并選取包括對氨基苯甲酸類、水楊酸酯類、肉桂酸酯類、二苯甲酮類、鄰氨基苯甲酸酯、樟腦類衍生物和二苯甲酰甲烷類等在內(nèi)的15種代表性紫外線吸收劑為研究對象，開發(fā)了化妝水、乳液、膏霜及唇膏等防曬類化妝品中的相關(guān)檢測方法。實驗結(jié)果表明，所建立的方法回收率高，精密度良好；用于實際樣品的檢測，成功檢出多例陽性樣品，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證，無假陽性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)，說明本研究改進的方法準確、可靠、普適性高，可用于防曬類化妝品中15種紫外線吸收劑的實際檢測工作。

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