姜 艷， 范桂芳， 杜 然， 李佩佩，姜 立， 趙 剛， 齊泮侖， 李十中*

（1.清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京100084；2.北京市生物燃料工程技術(shù)研究中心，北京100084；3.中國(guó)石油天然氣股份有限公司石油化工研究院，北京100000）

利用菌群降解木質(zhì)纖維素一步法生產(chǎn)燃料乙醇，由于操作工藝簡(jiǎn)單且無(wú)酶水解需要的纖維素酶成本，是近年來(lái)第二代燃料乙醇生產(chǎn)發(fā)展的重要方向［1-4］。測(cè)定菌群降解纖維素發(fā)酵液中各種糖類、有機(jī)酸及乙醇代謝成分組成的變化，對(duì)揭示其代謝途徑以及控制發(fā)酵過程，進(jìn)而從代謝工程角度改良菌群和優(yōu)化發(fā)酵工藝條件具有重要的意義。

傳統(tǒng)的第二代燃料乙醇生產(chǎn)技術(shù)首先將木質(zhì)纖維素預(yù)處理、酶解糖化成可發(fā)酵糖，然后經(jīng)過發(fā)酵將糖轉(zhuǎn)化為乙醇［4］。在纖維素降解產(chǎn)物分析中，Geng等［5］用毛細(xì)管電泳-電噴霧質(zhì)譜法檢測(cè)了木質(zhì)纖維素酸預(yù)處理過程中產(chǎn)生的碳水化合物和木質(zhì)素衍生物，Ibanez等［6］用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了木質(zhì)纖維素酸預(yù)處理過程中的微量有機(jī)酸抑制物。離子色譜［7-10］和液相色譜［11，12］方法已經(jīng)成功應(yīng)用于產(chǎn)物中糖和有機(jī)酸檢測(cè)；氣相色譜［13］已經(jīng)成功應(yīng)用于產(chǎn)物中醇和有機(jī)酸的檢測(cè)。

然而，菌群降解纖維素發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的體系中含有糖、有機(jī)酸和醇3大類物質(zhì)以及菌群的培養(yǎng)基，我們需要對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行具體分析來(lái)判斷能否同時(shí)檢測(cè)。培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)的干擾來(lái)自兩個(gè)方面，一是培養(yǎng)基中存在的鈣離子會(huì)與色譜柱說(shuō)明書里推薦的稀硫酸流動(dòng)相產(chǎn)生沉淀，從而堵塞色譜柱；二是培養(yǎng)基中包含的有機(jī)物也會(huì)在色譜圖里出峰。不同于化學(xué)降解法產(chǎn)物復(fù)雜［5，6］，纖維素生物降解產(chǎn)生的有機(jī)酸和醇相對(duì)簡(jiǎn)單；杜然等［1］、Wang 等［14］和Guo等［15］用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)出菌群發(fā)酵液的主要揮發(fā)性產(chǎn)物包含乙醇、乙二醇、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸和甘油；本文的研究體系用氣相色譜未檢測(cè)到丙酸，所以后續(xù)分析不考慮檢測(cè)丙酸。對(duì)于體系中可能存在的糖，由于本文采用的發(fā)酵底物濾紙是純纖維素，也就是葡聚糖以β-1，4糖苷鍵連接，其降解產(chǎn)物是纖維二糖和葡萄糖。綜合以上分析及色譜圖結(jié)果，本文確定纖維二糖、葡萄糖、乙醇、丁醇、甘油、乙酸與丁酸7種組分為代謝產(chǎn)物，并采用加酸除鈣和調(diào)節(jié)pH的樣品預(yù)處理方法，在HPLC儀器上利用Bio-Rad Aminex HPX-87H糖分析柱分離，利用示差折光檢測(cè)器（RID）檢測(cè)，建立了同時(shí)測(cè)定這7種組分的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

島津SHIMADZU液相色譜儀LC-20A（配島津化學(xué)工作站）；HERMLE Z216MK高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)HERMLE公司）；Cascada IX超純水設(shè)備（美國(guó) PALL公司）。乙醇（純度為 99.5%，美國(guó)MREDA公司）、丁醇（純度為99.5%，北京化工廠）、甘油（純度為99.5%，美國(guó)Amresco公司）、葡萄糖（純度為99.5%，美國(guó)Sigma公司）、纖維二糖（純度為99.0%，美國(guó) Sigma公司）、乙酸（純度為99.5%，北京化工廠）、丁酸（純度為99.0%，北京化工廠）。硫酸（純度為99.5%，北京化工廠）、乙酸乙酯（純度為 99.9% ，美國(guó) Sigma）。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H（300 mm ×7.8 mm）；流動(dòng)相：0.005 mol／L H2SO4；流速：0.5 mL／min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：60 ℃；檢測(cè)器：RID。

1.2.2 樣品預(yù)處理

取5 mL發(fā)酵液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，加入硫酸調(diào)節(jié)pH=3以防止有機(jī)酸離解并使鈣離子沉淀，離心（10 000 r／min，3 min）。上清液用 0.22 μm 水系膜過濾后進(jìn)樣。

1.2.3 定性與定量

在相同的條件下，將樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中各組分的色譜峰；在標(biāo)準(zhǔn)品與樣品進(jìn)樣量相同的情況下，應(yīng)用外標(biāo)法定量，計(jì)算樣品中各組分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系及檢出限

精確稱取纖維二糖、葡萄糖、甘油、乙酸、丁酸、乙醇、丁醇標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，各標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為 0.020、0.040、0.080、0.100、0.200、0.400、0.800 和 1.000 g／L。以峰面積y對(duì)質(zhì)量濃度x（g／L）進(jìn)行線性回歸，各標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)見表1。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，取S／N=3時(shí)組分的濃度為檢出限，結(jié)果見表1。

表1 化合物的保留時(shí)間、線性關(guān)系和檢出限（S／N＝3）Table 1 Retention times，linear relationships and limits of detection （LODs，S／N ＝3）of the compounds

2.2 組分的確定

在1.2.1節(jié)色譜條件下分別檢測(cè)待測(cè)糖、醇和有機(jī)酸的單標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定各組分的保留時(shí)間；相同條件下分別測(cè)定待測(cè)組分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、實(shí)際樣品和培養(yǎng)基溶液，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，各組分能有效分離，出峰順序?yàn)槔w維二糖、葡萄糖、丁醇、甘油、乙酸、丁酸和乙醇。

圖1 （a）標(biāo)準(zhǔn)溶液、（b）樣品和（c）培養(yǎng)基溶液的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of（a）standard solution，（b）sample and （c）cell culture solution

為了輔助定性幾種有機(jī)酸和醇，樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)氣相色譜分析（Agilent 7890A氣相色譜儀，火焰光度檢測(cè)器（FID），CP-Wax-57CB色譜柱（50 m ×0.25 mm ×0.2 μm），載氣為 N2）見圖2，圖2顯示了乙酸乙酯溶劑、乙酸乙酯萃取的標(biāo)準(zhǔn)溶液和乙酸乙酯萃取的樣品的氣相色譜分離圖。由圖2可知，該菌群發(fā)酵液中的主要揮發(fā)性產(chǎn)物為乙醇、丁醇、乙酸、丁酸，未檢出丙酸。本文采取的氣相色譜汽化條件沒能使甘油汽化，故氣相色譜分析沒有檢測(cè)到甘油。

2.3 回收率與精密度

取菌群降解纖維素發(fā)酵初始液1份，添加不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2節(jié)方法處理并按1.2.1節(jié)條件測(cè)定，每一加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率。由表2可見7種組分的平均加標(biāo)回收率為85.41%～115.60%，RSD≤4.62%。結(jié)果表明，在不同的加標(biāo)水平下，7種組分的回收率較為穩(wěn)定，精密度良好，滿足樣品分析要求。

表3為一個(gè)發(fā)酵樣品中目標(biāo)組分的測(cè)定結(jié)果。由表3可見，6次測(cè)定樣品中纖維二糖、葡萄糖、甘油、乙酸、丁酸、乙醇和丁醇質(zhì)量濃度的RSD分別為3.94%、0.97%、4.54%、3.19%、3.86%、4.47% 和4.70%。

圖2 （a）溶劑、（b）標(biāo)準(zhǔn)溶液和（c）樣品的氣相色譜圖Fig.2 GC chromatograms of（a）a solvent，（b）a standard solution and （c）a sample

表2 樣品中7種組分的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 2 Recoveries and RSDs of the seven compounds spiked in the samples（n＝6）

2.4 檢測(cè)過程的干擾因素

如圖1所示，由培養(yǎng)基帶來(lái)的主要色譜峰對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物色譜峰不形成干擾。但是保留時(shí)間在18.04 min處的小峰與產(chǎn)物乙酸的峰不能完全分離。當(dāng)發(fā)酵液中乙酸的質(zhì)量濃度為1.100 g／L時(shí)，兩個(gè)峰的分離度為2.333，基本滿足色譜分離的要求。

表3 菌群發(fā)酵液分析重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeated experiment results of microbial consortium fermentation broth g／L

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法建立了菌群降解纖維素發(fā)酵液中多種醇、有機(jī)酸和糖類化合物的定量分析方法。該方法準(zhǔn)確可靠，可實(shí)現(xiàn)對(duì)菌群降解纖維素發(fā)酵產(chǎn)物中纖維二糖、葡萄糖、甘油、丁醇、乙酸、丁酸和乙醇的同時(shí)快速、準(zhǔn)確和高效分離檢測(cè)，為研究纖維素菌群代謝途徑，優(yōu)化發(fā)酵過程提供了有效手段。

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